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Hola, mi nombre es Norma Andrews.
Soy un profesora de la Universidad de Yale, y lo que voy a hacer en esta tercera parte
de mi conferencia es hablar con Uds. acerca de los hallazgos que hemos logrado en mi laboratorio
en cuanto a las estrategias utilizadas tanto por Trypanosoma cruzi como Leishmania para invadir las células huésped
y por lo tanto sobrevivir dentro de los compartimentos generados dentro de esas células huésped.
Trypanosoma cruzi, como ya se ha detallado en la primera parte de esta conferencia,
es el agente causal de la enfermedad de Chagas,
una grave enfermedad endémica en Sud y Centroamérica
que se muestra aquí, en este niño infectado. Y esto es lo que se ve
en la sangre de estos pacientes durante la fase aguda de la enfermedad:
un gran número de estos parásitos altamente móviles que circulan en la sangre.
Esta etapa infecciosa es la forma depositada por el insecto después de succionar sangre,
así que la contaminación de la herida creada por la succión de sangre
es lo que transmite el parásito a través de las heces del insecto,
y este es el modo en que acceden al huésped mamífero.
Realmente la principal característica de Trypanosoma cruzi es que
es capaz de invadir y replicarse dentro de muchos tipos de células diferentes.
Este es el mecanismo que hemos estudiado durante varios años en mi laboratorio.
Nuestros conocimientos sobre este mecanismo comenzaron con estas micrografías electrónicas de barrido
tomadas por Edith Robbins en la Universidad de Nueva York.
Lo que se muestra aquí es la etapa infecciosa, tripomastigote
unida a una célula huésped. Y después
estos parásitos inician el dramático proceso de entrar en la célula huésped.
Se puede ver que se trata de parásitos grandes, y lo que es sorprendente ...
lo que nos sorprendió en estas primeras observaciones es que este mecanismo de entrada
era muy diferente de la fagocitosis.
Y nuestra hipótesis en ese momento era que estos parásitos entrarían por fagocitosis
porque son muy grandes, así que en teoría necesitarían la polimerización de la actina
en el lado de la célula huésped para expandir la membrana
y de ese modo acomodar una partícula tan grande.
Sin embargo, estas imágenes sugerían que algo muy diferente estaba pasando.
Para ilustrar, esto es lo que se ve en las células
cuando son sometidas a la fagocitosis.
Estas son las imágenes de las partículas grandes que están siendo incorporadas por los macrófagos,
mostrando cómo se ve esta profusión de seudópodos
y esta extensión de la membrana que gradualmente envuelve la partícula.
En cuanto a Trypanosoma cruzi, la entrada es muy diferente.
Estuvimos seguros de esto al hacer unos experimentos sencillos
de tinción de las células infectadas. Así, estas células fueron expuestas
a los parásitos sólo por períodos muy breves, de tan sólo 10 minutos,
y luego estos parásitos que se encuentran dentro de la célula...
Los parásitos han sido teñidos con anticuerpos contra las proteínas de superficie
(que se muestran en rojo) y después la célula se tiñe con faloidina,
en verde, la cual es una proteína que se une a la actina polimerizada.
Y pueden ver aquí cuán diferente es.
Los patrones observados con estos parásitos dentro de las células huésped
y lo que se ve en los macrófagos cuando absorben, por ejemplo, partículas de levadura,
donde se ve el clásico anillo de actina alrededor de la partícula,
y nosotros no lo vemos alrededor de los parásitos que han conseguido entrar en las células huésped.
Aunque los microfilamentos de las células todavía están presentes,
no parecen ser significativamente alterados por este proceso de invasión.
Las drogas que alteran el citoesqueleto de actina
tampoco tuvieron efecto inhibitorio en la entrada de Trypanosoma cruzi.
Pero, sorprendentemente, este proceso de invasión era muy sensible
a las drogas que alteran los microtúbulos,
que son el segundo elemento importante del citoesqueleto en las células,
que en realidad son elementos del citoesqueleto
que proporcionan las pistas donde se mueven los organelos.
Esta observación y esta segunda observación importante sobre los marcadores de lisosomas
(que se muestran aquí en esta inmunofluorescencia)
es que cuando se tiñen células que también han sido expuestas durante períodos breves
a las formas infectantes de Trypanosoma cruzi,
podemos ver que estos marcadores de lisosomas
(en este caso, los anticuerpos contra Lamp-1, una abundante glicoproteína de lisosomas)
están en una vacuola muy apretada que se forma
alrededor de los parásitos cuando entran en las células.
Esto también se veía muy diferente a la maduración clásica de los fagosomas
que se sabía que duraba varios minutos.
Se sabía que los lisosomas se encuentran con las partículas después de que ellas son internalizadas,
y aquí en este caso, eso parece ocurrir mucho más rápido
durante el proceso de invasión.
Lo importante de esta observación es que sabemos
que los lisosomas se mueven sobre los microtúbulos.
Así que estos dos hallazgos, que las drogas que alteran los microtúbulos
inhiben la entrada de Trypanosoma cruzi
y el hecho de que los marcadores de lisosomas se vean
asociados con la vacuola que rodea a estos parásitos,
estos dos hallazgos nos indicaron que probablemente el parásito tenía mecanismos muy particulares
para reclutar a estos organelos muy temprano en el proceso de invasión.
Eso es lo que se muestra en estas imágenes aquí. Arriba de nuevo tenemos la inmunofluorescencia,
en la cual los anticuerpos contra el parásito se añadieron a estas células
antes de que se permeabilizaron.
Sólo los parásitos fuera de la célula fueron teñidos de rojo.
Luego, estas células se permeabilizaron con detergente
y añadimos los anticuerpos contra las proteínas lisosomales,
por lo que podemos ver aquí que el segundo parásito dentro de la célula
en realidad está teñido por los marcadores lisosomales,
lo que indica que ya está dentro de la célula.
El hallazgo importante fue que vemos este patrón dramático
de la estrecha asociación de los lisosomas,
que están dentro de la célula, directamente debajo de este parásito
unido a la superficie,
indicando que había un proceso de señalización localizada
reclutando estos lisosomas exactamente al sitio de la invasión.
Y esto se ilustra quizás mejor aquí en esta microscopía electrónica de transmisión,
en la que los lisosomas se cargaron con peroxidasa de rábano picante,
lo que esto nos permite hacer una reacción citoquímica y visualizar estos lisosomas,
y se puede ver que el parásito todavía está completamente fuera de la célula,
pero estos lisosomas fueron reclutados al sitio de la invasión.
El siguiente paso en este proceso es que se pueden ver imágenes como ésta,
en la que esta parte del parásito todavía está fuera de la célula,
pero la porción que está adentro está rodeada por los marcadores de lisosomas.
Y lo mismo se ve aquí.
Este es un corte a través de un parásito que está en el proceso de entrar en las células.
En realidad es difícil distinguir la vacuola, porque se trata de una vacuola muy apretada,
pero hay dos membranas aquí, y este material que viene de los lisosomas
se entrega a esta vacuola muy apretada
que se forma alrededor del parásito cuando éste entra en las células.
En esta película aquí que voy a mostrarles,
éste es uno de fibroblastos, en el que el contorno
de la célula está aquí, y hay parásitos adheridos.
Y lo que se hizo aquí, es que esta célula se ha cargado previamente
con albúmina complejizada con oro
coloidal, por lo que los lisosomas en esta película aparecen como puntitos negros.
Y cuando ponemos esta película, podemos ver que en realidad, es posible
visualizar los microtúbulos como estas regiones elevadas
y es posible ver los lisosomas moviéndose en estos pasos muy grandes
hacia el sitio donde este parásito va a comenzar a invadir la célula.
Así pues, analizando estas películas ...
tomando la posición de cada uno de los lisosomas en cada período de tiempo,
es posible construir estos diagramas en los que se hace muy claro
que sólo en las regiones poco alejadas del sitio de la invasión,
los microtúbulos muestran
el comportamiento conocido, un movimiento saltatorio que es bidireccional.
Pero, cuando se acerca al sitio donde va a suceder la invasión,
existen estos pasos drásticos de dirección
que se pueden ver quizás más fácilmente aquí con estas flechas,
lo que indica que este movimiento direccional está pasando
en esta zona de influencia del parásito,
pero antes de que la invasión se inicie.
Esto es realmente lo que nos llevó después a estudiar en detalle el proceso de señalización que estuvo involucrado
en este proceso. Y lo que hemos aprendido es que los parásitos producen un agonista
que interactúa con los receptores en la célula huésped, se activa la fosfolipasa C
y la producción de IP3, que es un mediador
para la liberación de calcio desde los depósitos intracelulares.
Hay una elevación en el calcio intracelular,
y eso es lo que esta película aquí muestra.
Esta célula se cargó con un colorante sensible al calcio y fue expuesta a los parásitos.
Y podemos ver cómo estas células brillan de forma continua
mientras están estimuladas por el parásito,
mostrando aumentos transitorios en el calcio citosólico, libre.
Hemos demostrado en una serie de experimentos que esta elevación de calcio es necesaria
para este reclutamiento de lisosomas en el sitio de la invasión del parásito.
Lo que hemos aprendido a través de este proceso...
(Este es un muy buen ejemplo de los hallazgos inesperados
que pueden pasar)...Mediante el estudio de este parásito exótico de Sudamérica,
llegamos a entender algo muy básico
sobre el comportamiento de los lisosomas convencionales en células de mamífero.
Cuando decidimos sacar los tripanosomas de la imagen
y observar el efecto de la elevación de calcio en el citosol,
aprendimos que en realidad muchos tipos diferentes de células...
Los lisosomas, los cuales fueron vistos originalmente,
(o todavía se ven constantemente)
como compartimentos terminales de la vía endocítica ...
En realidad, estos orgánulos se pueden transformar
en secretores y organelos secretores regulados,
simplemente elevando la concentración de calcio citosólico.
Y yo no voy a describirlo en esta conferencia, pero hemos aprendido, en mi laboratorio,
que este proceso es muy importante en la fisiología de células de mamífero.
Para, por ejemplo, la reparación de heridas mecánicas en la membrana plasmática,
y también para la fagocitosis, como un mecanismo
para añadir más membrana en los sitios de fagocitosis.
Lo que les voy a mostrar,
en colaboración con Sandy Simon de la Universidad Rockefeller,
es cómo hemos podido visualizar directamente
este proceso de exocitosis lisosomal.
Para ello, se utiliza una técnica de gran alcance, la microscopía de reflexión interna total.
Lo que se indica aquí, en esta técnica, es que las células se iluminan
desde el fondo con un rayo láser, y el láser se dirige a las células en un ángulo
en el que la mayor parte de la luz es reflejada,
por lo que la pequeña cantidad de luz que penetra
estas células lo hace a un campo muy estrecho que se llama el campo evanescente.
Y se llama el campo evanescente
porque tiene esta propiedad muy interesante de descomponerse
exponencialmente lejos del cubreobjetos donde están las células.
Si se añade un marcador fluorescente a las vesículas de interés,
es posible visualizar estas vesículas haciéndose más y más brillantes
a medida que viajan a través de este campo evanescente,
y luego el momento de la fusión es bastante evidente
porque hay fluorescencia de alta intensidad y luego difusión de la marca.
En estos estudios, Jyoti Jaiswal y Sandy Simon observaron
algo muy interesante que no sabíamos cuando empezamos estos estudios.
Se sabe que los lisosomas se concentran en las células en la zona perinuclear,
que se muestra aquí en la clásica microscopía de epifluoresencia.
Y lo que esta técnica de la microscopía TIRF demostró es que,
además de esta población perinuclear,
hay un número significativo de lisosomas
que se puede ver en esta región muy membrano-proximal
que está a sólo 80 o 100 nanómetros cerca de la membrana plasmática.
Esta fue una observación importante porque cuando estos eventos de fusión se analizaron ...
Voy a mostrar un ejemplo, aquí, en el que se trata de un fibroblasto embrionario.
Una vez más, igual que en las fotos anteriores, los lisosomas se cargaron
persiguiendo una molécula fluorescente, dextrano,
a lo largo de la vía endocítica, y luego acumulándolo en los lisosomas.
Y esta película va a mostrar, cuando comience, que ahora
esta célula está siendo estimulada por un ionóforo de calcio.
Y vamos a ver estas bocanadas de fluorescencia,
que muestran que el dextrano luminal ha sido liberado.
Me gustaría que Uds. se centraran en este lisosoma aquí que se vuelve cada vez más brillante,
y vamos a ver el momento en que este
lisosoma se fusiona con la membrana plasmática,
liberando su contenido.
Cuando Jyoti Jaiswal y Sandy Simon analizaron estos eventos,
quedó claro que en las células estimuladas o con un ionóforo de calcio
o con los dos agonistas más fisiológicos, trombina y bombesina,
la gran mayoría de los lisosomas que se fusionaron con la membrana plasmática
provenían de esta población membrano-proximal.
Muy pocos, que se muestran en rojo, fueron reclutados de las regiones más profundas de la célula,
lo que significa que primero eran invisibles y entraron en el campo de luz.
Por lo tanto, esto nos proporcionó la información muy importante
de que esta población periférica de los lisosomas
(que no había sido realmente descrita antes) en realidad es funcional y
responsable por la mayoría de estos eventos de fusión que son modulados por el calcio.
Esto hizo que nos interesáramos en la maquinaria molecular que controla la exocitosis lisosomales,
y que se muestra aquí en este diagrama de una revisión de Ed Sheckman.
Ahora se entiende bien,
por el trabajo de Ed Sheckman y varios otros, que esta clase de moléculas,
los sinaptotagminas, son muy importantes en el acoplamiento de calcio
a los eventos de fusión de membranas.
Así que lo que se indica aquí son las moléculas SNARE, en las que
los v-SNARE están en la membrana de las vesículas
y los t-SNARE en las membranas aceptoras.
Y estas moléculas forman unos paquetes apretados, espirales,
los cuales se consideran responsables por promover la fusión de membranas.
Este proceso se puede hacer sensible al calcio cuando las moléculas de sinaptotagmina interactuan
con las proteínas SNARE después de unión al calcio,
y se unen al calcio a través de estos dos dominios
que tienen en su región citoplasmática,
que son los dominios C2.
Estas moléculas sensores de calcio, asociadas con las membranas,
eran candidatas muy interesantes
para mediar también la exocitosis lisosomal
la cual, como aprendimos, fue un proceso claramente controlado por las elevaciones de calcio en el citosol.
Nos interesamos en una isoforma específica, sinaptotagmina VII,
porque se expresa de forma ubicua,
ha sido evolucionalamente conservada (por lo que es una de las isoformas conservadas en Drosophila
y otros organismos inferiores, incluyendo C. elegans),
y tiene una distribución muy amplia, lo que podría ser consistente
con una localización lisosomal.
Esto fue confirmado en varios estudios en nuestro laboratorio.
Estoy mostrando aquí un ejemplo aquí de inmunofluorescencia,
en el que los anticuerpos específicos para sinaptotagmina VII en rojo
se utilizan para teñir una célula que también está infectada con Trypanosoma cruzi.
Y podemos ver aquí que, además de los lisosomas, que están aquí, (teñidos con verde
con anticuerpos contra Lamp-1) podemos ver una superposición muy buena,
que se muestra en la imagen amarilla aquí abajo,
mostrando que la sinaptotagmina VII se localiza en los lisosomas en células de mamíferos y es
también entregada a la vacuola que está alrededor de Trypanosoma cruzi después de la invasión
al igual que otros marcadores lisosomales. Y luego demostramos que
la falta de esta molécula, sinaptotagmina VII, puede inhibir no sólo la exocitosis lisosomal
inducida por calcio, sino también la invasión de estas células por Trypanosoma cruzi.
Un trabajo adicional nos permitió identificar a los componentes de esta reacción de fusión:
las moléculas SNARE (en las cuales el VAMP7 presente en los lisosomas
interactúa con syntaxin 4) y 23-SNAP.
Y sinaptotagmina VII se asocia con estas moléculas de una forma calcio-dependiente
que nos llevó a proponer que también es similar
a lo que se ha mostrado en las vesículas sinápticas
en las células neuronales, que así sería cómo este proceso se vuelve regulados por el calcio.
Estos eventos de fusión lisosomales realmente se han demostrado
críticos no sólo para la invasión de Trypanosoma cruzi,
pero están, interesantemente en el trabajo más reciente del laboratorio.
Entendimos que este evento es muy importante para conservar
estos parásitos altamente móviles dentro de las células anfitrionas.
Así, después de que los tripanosomas invaden, como ya les mostramos,
durante el proceso de invasión,
hay una fusión gradual de los lisosomas,
y se sabe que los lisosomas están asociados con
estos caminos de microtúbulos a través de los motores moleculares.
Y creemos que este proceso es muy importante para mantener
estos parásitos dentro de la célula huésped
para la finalización del ciclo.
Parte de la evidencia para esto se indica en este diagrama aquí;
cuando prevenimos la fusión lisosomal con diferentes procedimientos,
estos parásitos todavía pueden entrar en las células por la invaginación de la membrana plasmática,
probablemente impulsados por su motilidad muy activa.
Pero curiosamente, esta entrada puede ser reversible, así que si no existe la fusión lisosomal
y no hay ninguna atadura a la red de microtúbulos,
estos parásitos en realidad pueden salir de la célula,
y este proceso de invasión en realidad puede ser reversible.
Así que este es un concepto interesante que creo que resultará
ser cierto para otros patógenos móviles.
Tienen que ser capaces no sólo de invadir las células
y crear un compartimiento intracelular,
sino que también de ser retenidos dentro de las células huésped.
Lo que esta imagen muestra aquí es un resumen de lo que hemos aprendido.
El proceso de señalización inducida por tripanosomas en células huésped
desencadena esta elevación de calcio en el citosol,
que impulsa esta fusión de lisosomas en el sitio de la invasión.
Esto proporciona a los parásitos unas membranas provenientes de la célula huésped,
en las que forman este compartimiento inicial.
En el caso de Trypanosoma cruzi, se escapan de este compartimiento muy pronto,
pocas horas después de la invasión, en algunos tipos de células,
y completan el proceso en el citoplasma,
como ya expliqué en la primera parte de esta conferencia.
Estábamos interesados, además de este proceso de inscripción,
en la comprensión de cómo los parásitos sobrevivan en estos compartimentos parecidos a los lisosomas,
que son tan degradativos y, en teoría, deberían promover la destrucción
y no la supervivencia de estos patógenos.
Para esta pregunta, recurrimos a Leishmania,
lo que también ya se presentó en el segundo segmento de esta conferencia.
Es un parásito transmitido...está estrechamente relacionado con Trypanosoma cruzi.
Se transmite por mosquitos de la arena, y cuando estas formas infecciosas
se introducen en el huésped mamífero,
invaden los macrófagos y se replican en el interior de estos compartimentos parecidos a los lisosomas.
Esto se muestra aquí en una imagen de un paciente con una forma cutánea de la enfermedad,
que es una consecuencia del proceso inflamatorio
que se desarrolla cuando estos parásitos se replican dentro de los macrófagos.
Por lo tanto, lo interesante de Leishmania es que están adaptados, como se muestra aquí,
en estos ejemplos de varias especies de Leishmania:
donde la vacuola se forma alrededor de este parásito
y donde se replican hay marcadores de lisosomas.
Hay muchos estudios donde esto se muestra,
sobre todo los de Jean-Claude Antoine en el Instituto Pasteur de París,
como compartimentos lisosomales, así que la nueva pregunta es
¿cómo sobreviven al interior de estos compartimentos degradativos?
Por lo tanto, esto nos lleva a un camino muy interesante en células de mamíferos,
que es el mecanismo por el cual las células adquieren hierro.
Las células de mamíferos tienen receptores para la transferrina,
que es la proteína transportadora de la forma oxidada de hierro, Fe 3 +.
Es entendido que los receptores para la transferrina se endocitosan
y dentro de estos endosomas tempranos, cuando el pH desciende,
el hierro se libera de la transferrina
y luego la transferrina se recicla de nuevo fuera de la célula,
y el hierro que se libera se transloca en el citosol.
La forma en que esto sucede es por la reducción en Fe2 + por reductasas al interior del endosoma,
y luego tenemos los transportadores específicos.
En el caso de los endosomas tempranos, este transportador se conoce como Nramp2
y es responsable de la translocación de una gran fracción
del tráfico de hierro a través de esta vía en el citoplasma,
donde se hace accesible para los procesos metabólicos de la célula de mamífero.
Lo que era un tema de debate durante mucho tiempo, pero ahora se hace cada vez más claro
es que otro transportador, Nramp1, funciona de una manera similar a Nramp2,
pero es más profundo en la vía endocítica, por lo que se encuentra sobre todo en los lisosomas.
Lo que es muy interesante acerca de Nramp1 es que es ampliamente conocido
como un gen de susceptibilidad a enfermedades infecciosas.
Así, desde hace bastante tiempo, ha quedado claro que las mutaciones en Nramp1
promueven la susceptibilidad a varios patógenos
como Leishmania, salmonella y micobacterias,
que se replican dentro de la vía endocítica.
Esto crea algunas preguntas muy interesantes y también ilustra el hecho de
que este mecanismo de gradualmente agotar la vía endocítica en el hierro
es un mecanismo de resistencia contra los agentes patógenos
porque esto limita severamente el acceso de estos organismos intracelulares a esta clave
metal que se necesita para muchas reacciones enzimáticas importantes.
Queríamos entender cómo Leishmania adquiere el hierro
en estos compartimentos, ya que estaba claro que este es el tipo de compartimiento
donde se replican y, a diferencia de las bacterias,
no se sabía nada acerca de cómo la Leishmania podría adquirir hierro intracelular.
En mi laboratorio, este trabajo fue realizado por un investigador de gran talento, Huynh Chau,
quien hizo esta pregunta: ¿cómo adquiere hierro la Leishmania
en estos compartimentos muy especializados y parecidos a los lisosomas,
de los cuales se muestra un ejemplo aquí, estos compartimentos altamente expandidos
que son típicos de Leishmania amazonensis.
Lo que encontró Chau al hacer búsquedas de homología en el recientemente finalizado genoma
de Leishmania, fue una proteína que llamó LIT1, por Leishmania Iron Transporter 1,
y que mostró una identidad significativa de 30% y 54% de similitud
con un transportador de hierro conocido de Arabidopsis.
Esta es la estructura de este transportador. Cuenta con 8 dominios de transmembrana,
y estos residuos, que han demostrado ser críticos
en el transporte de hierro, son altamente conservados
en la proteína Leishmania.
Chau postuló que ésta sería miembro de la familia ZIP de transportadores de metal,
y lo que hizo inicialmente fue producir anticuerpos
específicos contra esta proteína de Leishmania.
Y curiosamente, él no pudo detectar esta proteína por inmunofluorescencia
en los parásitos que habían invadido recientemente las células.
Tampoco pudo verlo en las etapas extracelulares de Leishmania.
Así que lo que se muestra aquí en azul es sólo el parásito ...
el ADN de la célula huésped y de los parásitos,
y podemos ver que no hay tinción con el anticuerpo que se muestra en verde.
Pero si sólo esperó 24 horas ... Así que este parásito todavía no ha empezado a replicarse,
pero se puede ver que el compartimiento se ha ampliado en gran medida,
y el parásito va a empezar pronto a replicarse.
En esta fase, existe claramente una señal con los anticuerpos contra esta proteína LIT1,
y en esta parte ampliada aquí, podemos ver que el patrón es lo que cabría esperar.
Se distribuye alrededor de la superficie de estos parásitos intracelulares.
Lo que Chau hizo después fue obtener pruebas
que esto podría funcionar como un transportador de hierro.
Primero hizo experimentos en los que introdujo este gen LIT1 de Leishmania
en cepas de levadura que son defectuosas en el transporte de hierro.
Lo que se muestra aquí es que si se cultivan estas cepas en medios ricos en hierro,
todavía pueden crecer,
a pesar de que faltan dos principales vías de transporte de hierro.
Pero cuando el hierro está quelado en el medio, no pueden crecer.
Pero simplemente introducir el gen LIT1 nos permite rescatar el crecimiento de estas cepas,
realmente proporciona una fuerte evidencia de que LIT1 puede funcionar como un transportador de hierro.
Lo que se muestra aquí es la demostración directa de que LIT1
funciona como un transportador de hierro en Leishmania.
Por lo tanto, Chau creó un mutante nulo (un mutante knockout) que carece de LIT1
y lo comparó con los parásitos que habían sido complementados con este gen.
Esta curva de aquí es la absorción de hierro radiactivo por estos parásitos complementados,
y se puede ver que es muy diferente de los niveles muy bajos
observados en estas formas knockout.
Este knockout fue construido por esta técnica estándar en el campo
de recombinación homóloga.
LIT1 es en realidad codificada por dos genes, LIT1A y LIT1B,
pero estos genes están lo suficientemente cerca uno de otro pa ser eliminados
(suprimidos) en un paso de recombinación homóloga
por sustitución con un marcador seleccionable.
En Leishmania esto sólo requiere que se haga en dos etapas,
con dos marcadores seleccionables diferentes, porque éstos son organismos diploides.
Una vez que estos parásitos se generan, Chau podría mostrar aquí,
de nuevo por inmunofluorescencia,
que esta proteína se detecta en la superficie de los parásitos sólo en la cepa salvaje,
pero no está presente en el mutante.
Lo interesante fue el comportamiento de estas formas dentro de los macrófagos.
Esto aquí muestra cómo Leishmania amazonensis crece dentro de los macrófagos,
formando estos compartimentos extremadamente ampliados
que contienen la proteína lisosomal, Lamp-1,
que se muestra en verde.
Por aquí en azul está la ADN teñida, que muestra los parásitos replicándose,
en asociación con la membrana de estas vacuolas.
Cuando el mismo periodo de tiempo fue analizado en células
infectadas con parásitos que carecen de la proteína LIT1,
pudimos ver que las etapas iniciales eran muy similares.
Los parásitos en realidad pueden infectar las células, pueden ampliar inicialmente la vacuola,
pero luego no se dividen.
Esto se indica aquí por la DAPI mostrando que el número de parásitos
sigue siendo similar a lo largo de las varias horas que esta infección fue observada.
Esta es la cuantificación del proceso,
que muestra que los parásitos de tipo salvaje aumentan en número,
al replicarse al interior de las células huésped.
Y en ***, vemos cómo estos parásitos knock-out no crecen,
pero si el gen LIT1 se reintroduce en esta cepa knock-out, el crecimiento es rescatado.
Esta fue la demostración formal de que en realidad LIT1 es un requisito esencial
para el crecimiento intracelular en macrófagos,
que esta vía de adquisición de hierro es realmente un requisito fundamental para que la Leishmania
sobreviva en este compartimento desventajado, pobre en hierro,
de los endosomas o lisosomas atrasados.
Con la ayuda de David Sacks en el NIH, también se analizó la capacidad de
de estos parásitos knockout de causar patología en ratones,
y esta forma cutánea de Leismaniasis puede ser reproducida en ratones
mediante la inyección de los parásitos en la almohadilla plantar.
Esto tiene un patrón muy claro: cuando los animales son inyectados con organismos de tipo salvaje
una lesión se desarrolla en la almohadilla de la pata.
De acuerdo con lo observado en los macrófagos en la cultura,
estos parásitos no forman lesiones en los ratones
incluso después de ser inyectados en grandes cantidades
y seguidos por varios meses en los animales.
La única observación es que, a pesar de la ausencia completa de la patología,
estos parásitos mutantes que carecen de la proteína LIT1 podrían ser recuperados
a partir de los tejidos de estos ratones, lo que indica la persistencia.
Este es un punto muy importante e interesante y yo diría
que es una pregunta muy importante para la investigación futura.
¿Cómo Leishmania sobrevive y persiste en los tejidos del huésped
incluso después de que la respuesta inmune efectiva se desarrolla?
Se sabe que en condiciones fisiológicas, cuando un pequeño número de parásitos se inyectan
las lesiones suelen sanar, pero persisten los parásitos,
y no se sabe en qué tipo de célula
estos parásitos son persistentes y cómo sobreviven y evitan la eliminación
cuando su célula huésped principal (por lo menos la célula huésped importante que es bien conocida)
es el macrófago.
Este es el punto que espero que vamos a llegar a entender mejor en el futuro
cuando empecemos a profundizar en cuáles son los requisitos para la supervivencia de Leishmania
en el huésped mamífero.
Me gustaría agradecer a toda la gente muy talentosa
(postdocs y estudiantes)
que a lo largo de los años han contribuido a la labor que he mencionado aquí,
y también me gustaría agradecer a los colaboradores importantes en este trabajo
y también a las fuentes de financiación, que eran principalmente la NIH,
el Fondo Burroughs Wellcome, y el Programa de Ciencia "Fronteras Humanas ".
Gracias.