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CIRM: INSTITUTO DE MEDICINA REGENERATIVA DE CALIFORNIA.
REPROGRAMACIÓN DIRECTA: GENERACIÓN DE MÚSCULOS
EN UN CORAZÓN EXISTENTE.
DR. DEEPAK SRIVASTAVA.
DIRECTOR DEL INSTITUTO GLADSTONE
PARA ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES
Y EL CENTRO RODDENBERRY DE CÉLULAS MADRES, EN GLADSTONE.
Si bien nuestra meta es crear partes de corazón completas,
el objetivo más inmediato, que podemos alcanzar
no en cinco o diez años sino en un futuro más cercano,
es poder regenerar nuevos músculos en un corazón existente.
En partes existentes del corazón.
Y esto podría ser muy ventajoso en numerosas formas
de insuficiencia cardíaca en niños y en adultos.
Pueden ver una de ellas aquí, causada por ataques cardíacos,
por supuesto en adultos, donde un vaso coronario se obstruye,
se pierde el flujo sanguíneo hacia esa parte del corazón
y esas células musculares mueren.
El resultado es la cicatriz que pueden ver a la derecha.
Aquí está indicada en azul, donde la pared del ventrículo
se vuelve muy delgada, y se vuelve un tejido fibrótico.
Un corazón tiene muy poca o ninguna capacidad de regenerarse,
por lo que, uno tiene esta cicatriz permanentemente
y con el tiempo el corazón se deteriora y empeora más y más.
Y esto es algo que afecta a cinco millones de estadounidenses.
Actualmente, la única solución es un trasplante de corazón
una vez que estos defectos cardíacos han alcanzado un estado crítico.
Pero solo dos mil trasplantes tienen lugar anualmente en los EE.UU.
como resultado de una clara escases de donantes.
Lo que sabemos es que el corazón no está hecho solo de músculo.
De hecho, menos de la mitad de las células del corazón son músculo.
La otra mitad de las células del corazón
son lo que llamamos fibroblastos,
que son solo células que soportan la arquitectura del corazón
y envían señales importantes a los músculos adyacentes.
Pero los fibroblastos también se activan tras sufrir una herida,
migran al lugar del daño y generan el tejido cicatrizal.
Entonces, lo que comenzamos a preguntarnos hace unos años
es: si el corazón tiene esta reserva de células dentro del órgano,
¿podríamos nosotros,
en lugar de reprogramar fibroblastos como células madre,
como hizo Shinya Yamanaka,
convertir directamente los fibroblastos en el órgano
en cardiomiocitos nuevos?
De ser así, podríamos tomar ese gran potencial de células en el órgano
y convertirlas en nuevas células musculares
para usarse en medicina regenerativa,
sin tener que poner nuevas células en el órgano...
y seguramente habrán oído y visto al analizar tantas subvenciones,
todos los problemas que intentamos superar
en las terapias que consisten en la introducción de células.
Creo que podemos superarlos, con el tiempo, pero hay mucho que resolver,
y esta podría ser una solución un poco más fácil.
Entonces... el enfoque que asumimos fue volver
a la forma en que la naturaleza suele crear un corazón,
y pasamos los últimos 15 años intentando descifrar esas redes,
y nos preguntamos si, al tomar esa información
y redirigirla en su totalidad hacia una célula fibroblástica en una placa
podríamos conseguir que una célula se asemeje más a un cardiomiocito.
Y de hecho logramos hacerlo.
Y resulta ser que la combinación de tres genes reguladores maestros,
algunos de los cuales ya les mencioné,
son suficientes para convertir un fibroblasto cardíaco
en una célula similar a un músculo.
Esos genes son GATA4, el cual causa enfermedades en los seres humanos,
Tbx5, el cual causa una enfermedad similar,
y un tercer factor, Mef2c.
En una placa, estos tres factores pueden empujar a las células
hacia un estado similar al de un cardiomiocito,
pero la mayoría de las células son reprogramada parcialmente
y solo algunas pocas se convirtieron en células cardíacas latentes,
incluso en plástico.
Pero lo que realmente queríamos saber no era si podía hacerse en plástico,
sino si podía hacerse en un organismo vivo
y específicamente en el corazón de un animal.
Entonces hicimos ese experimento recientemente.
Obstruimos la arteria coronaria de algunos ratones
para imitar un ataque cardíaco,
inyectamos los tres factores con el virus, como una terapia con genes,
esperamos unas semanas y luego extrajimos esos corazones,
y dispersamos las células del corazón en una placa
para poder examinar cada una individualmente
y ver cuán bien podíamos reprogramar las células
para crear nuevas células musculares.
Cerca del 50% de esas células se parecen a estas.
Lo que hicimos fue etiquetar y rastrear genéticamente esas células
que empezaron como fibroblastos y se convirtieron en células musculares
con el marcador rojo que ven aquí,
y cerca del 50% de las células se ven así.
Se ven básicamente como una verdadera célula muscular cardíaca
que pueden ver aquí.
Eso era bastante bueno.
Y si impregnábamos las células con marcadores de...
de lo que llamamos sarcomeros, o las unidades latentes del músculo,
se ven así
La célula verde es una célula de músculo cardíaco real o nativa,
y la amarilla es una célula de músculo cardíaco nueva,
que solía ser un fibroblasto.
Como pueden ver, estas también tienen esas hermosas estriaciones,
típicas de las células de músculo cardíaco.
Pero la verdadera pregunta en estas situaciones
es si estas células pueden latir.
Porque la prueba para las células cardíacas es muy rigurosa,
ya sea que estén completamente reprogramadas, o no.
Entonces, resulta ser que, cuando reprogramamos células
en su ambiente nativo "en vivo", con todas las señales correctas
y la presión y las fuerzas mecánicas que pueden experimentar,
más del 50% de las células reprogramadas
llegan a latir... y eso es lo que pueden ver si reproduzco este vídeo.
Esta célula verde fluorescente ha sido etiquetada genéticamente
para señalar que solía ser un fibroblasto,
o una célula no muscular. Y esta es una célula muscular real
que ya se hallaba en el corazón que extrajimos.
Ahora pueden ver que si estimulamos a ambas células con electricidad,
estas se contraen.
Y, como dije, cerca del 50% de las células verde fluorescente
pudieron ser reprogramadas completamente de esta forma.
Esto nos alentó mucho, y procedimos...
a ver si podían hacer alguna diferencia "en vivo".
Pero antes de hacerlo debíamos confirmar algo muy importante:
no basta con crear una célula muscular que lata en el corazón,
si no se conecta eléctricamente con sus vecinas.
Estaría aislada, no generaría fuerza, pero por sobre todo,
sería una posible fuente de alteraciones del ritmo cardíaco.
Por eso este experimento que les mostraré era crítico.
Consiste en determinar si las células pueden conectarse entre sí,
tanto con las nuevas como con las existentes.
Lo que pueden ver aquí es un grupo de células que hemos aislado
de un corazón reprogramado "en vivo".
Ahora ya no es una sola célula, sino que tenemos tres células.
Uno, dos y tres.
Solo la célula roja es nueva, las otras dos son células viejas.
Cuando adelanto el vídeo hasta este punto...
podemos ver la ola de calcio que atraviesa estas células.
Lo que verán es que cuando estimulamos a las tres células,
tenemos una ola sincronizada.
Eso significa que están conectadas eléctricamente entre sí,
y por lo tanto laten al mismo tiempo.
Sabiendo esto, procedimos a hacer la prueba.
Pero olvidé que quería mostrarles este vídeo.
Así que, solo para ilustrar lo que hemos hecho, con un diagrama...
Supongo que muchos de ustedes han visto este diagrama de Waddington
con esta colina y una bola rodando y una célula pluripotente
convirtiéndose en un tipo de célula específico.
Y probablemente conozcan también el trabajo de Shinya Yamanaka,
en que básicamente tomó estas bolas y las hizo rodar hacia arriba
hasta volverlas a su estado pluripotente,
desde donde podían volver a asumir cualquiera de los otros estados.
Nosotros hicimos algo diferente. Básicamente tomamos estas células
y las hicimos saltar la colina, si se quiere,
de un tipo de célula adulta, directamente hacia otro,
sin tener que subir la colina y luego volver a bajar.
Nos referimos a esto como "reprogramación directa",
porque va directamente de un tipo de célula somática adulta al otro.
Bien, este es entonces el experimento pre-clínico.
Tomamos ratones blancos grandes, simulamos estos infartos,
inyectamos factores reprogramantes y sometimos a los ratones
a ecocardiogramas en momentos predeterminados,
para saber si incluso con una inyección tan cruda en el músculo
podíamos generar una diferencia en su funcionamiento.
Finalmente hicimos resonancias magnéticas...
porque es realmente el mejor examen para estudiar funciones cardíacas.
Lo que ven a su izquierda es una resonancia representativa
y la cuantificación en decenas de ratones en cada categoría.
Esta línea de puntos de aquí indica la...
la función cardíaca en una resonancia de un ratón sin infartos.
Esta barra azul representa a los ratones de control,
que sufrieron un infarto, pero fueron inyectados con un virus
que era solo un virus de control, conteniendo un gen de control,
y pueden ver que ha disminuido.
Y finalmente, la barra verde indica a...
los ratones experimentales a los que inyectamos los tres reprogramantes.
Claramente no es normal, pero es mucho mejor que sin tratamiento.
Y las resonancias representativas, como dije, están a la izquierda.
Si diseccionamos a estos ratones tras sacrificarlos,
los de control se ven así, donde pueden ver en un corte transversal
que muestra el ventrículo izquierdo,
que esta es la pared delgada del ventrículo izquierdo,
con el tejido cicatrizal y... los ratones tratados se ven así...
aún hay una reducción del ventrículo y hay una cicatriz,
pero podemos comenzar a ver músculo en el área cicatrizada.
Y pudimos etiquetar genéticamente esas células
para saber si esas células rojas que pueden ver
en esta área cicatrizada... área reducida...
son miocitos residuales o nuevos, y...
los etiquetamos genéticamente, y solo les diré que son, de hecho, nuevos
y tienen los marcadores que nos dicen que no eran miocitos,
así que son, de hecho, nuevas células reprogramadas.
Esto nos alentó mucho...
porque creemos que representa una potencial forma
de regenerar músculo cardíaco
sin inyectar células, con los problemas que ello implica,
sino tomando las células que ya están en el órgano, y engañándolas
para que hagan algo que normalmente no harían.
Hay mucho que hacer al avanzar para comprender la biología de esto.
Entonces, con la ayuda de una subvención de bilogía de CIRM,
estamos intentando agresivamente comprender por qué ocurre esto,
lo que implica descubrir el lugar de estos tres factores de transcripción
que controlan miles de otros genes en la cadena de ADN,
y qué es lo que encienden y apagan para que esto suceda.
Y como les dije al hablar de nuestros primeros resultados,
esto sucede en razón de horas.
Es increíble ver lo rápido que el genoma es reprogramado
por estos factores.
Y en razón de tres días, la mayoría de los cambios transicionales
que atraviesa el genoma, ya se han producido.
Luego, a lo largo de las siguientes semanas
se produce un afinamiento de los cambios genéticos
que resultan en el fenotipo del cardiomiocito,
pero la mayor parte de la actividad se produce muy, muy temprano,
y no anticipamos ni esperábamos que ese fuera el caso.
Y ahora tenemos las herramientas para comprender la epigenética
y los cambios transicionales que se producen a intervalos de horas.
Y eso es exactamente lo que estamos haciendo con su ayuda.
Ahora bien, aunque nos esforcemos por comprender esto
y refinar la tecnología...
estamos avanzando agresivamente con ensayos pre-clínicos
en animales más grandes, y específicamente el cerdo,
para ver si esta estrategia funciona con un corazón más grande,
cuyo tamaño y fisiología se asemejan más al de un humano.
Y es con la ayuda de la subvención de transición temprana de CIRM
que ahora podemos hacer nuestros estudios en cerdos,
para probar tanto la eficacia... de este enfoque,
como la seguridad.
Por ello hemos comenzado con nuestro primer grupo de cerdos,
para evaluar cómo se producen los cambios y qué niveles obtenemos.
Y... tengo muchas esperanzas de que durante el próximo año o año y medio
comencemos a obtener resultados, para saber si...
este enfoque realmente funciona en un corazón más grande.
Estamos muy, muy emocionados por esto y, nuevamente, muy agradecidos.
No podríamos hacer este trabajo de ninguna otra manera.
Es muy costoso, y el Instituto Nacional de Salud
simplemente no apoya este tipo de trabajo,
que ya no se encuentra en una etapa de descubrimiento,
sino que es una etapa de transición para mover esto hacia...
una etapa pre-clínica.
Bien, cerraré esta charla, diciendo que este enfoque nos emociona tanto
porque no creemos que se aplique solo al corazón.
Tenemos evidencia de que, al menos en una placa,
se pueden reprogramar en forma directa, muchos otros tipo de células
y convertir células somáticas adultas no solo en células cardíacas,
sino también en células nerviosas...
como demostraron colegas en Gladstone y Marius Wernig en Stanford...
en células hematológicas, células hepáticas, células pancreáticas...
y... esperamos que otros hagan estos estudios "en vivo"...
La semana pasada un grupo informó que lograron convertir, "en vivo",
células nerviosas, neuronas, en células similares a neuronas motoras,
que se pierden con la esclerosis lateral amiotrófica.
Por ello creo que pueden ver esta estrategia
desde múltiples enfoques de medicina regenerativa,
porque la biología de desarrollo que afecta a estos tipo de células
es algo que hemos llegado a comprender bastante bien.
Y es esa biología de desarrollo, la que nos permite...
mover los interruptores, si se quiere,
y decirle a una célula que sea lo que nosotros queremos que sea.
Entonces... cerraré mi exposición diciendo que...
creo que la combinación de los poderes de la genética humana,
junto con la biología de células madre
usada especialmente en la tecnología de reprogramación,
nos han otorgado una oportunidad sin precedentes
de comprender enfermedades humanas en formas que solían ser imposibles,
a través de la creación de modelos de enfermedades, y...
sustentar nuestro conocimiento para comenzar a pensar
nuevas formas de regenerar órganos a medida que avanzamos.
Por ello quiero agradecer a los miembros de mi laboratorio,
que pueden ver aquí y son un grupo de gente de lo más brillante.
En esta foto hay muchos becarios de CIRM
que han recibido ayuda a través de becas de capacitación de Gladstone,
y todos ellos usan nuestras instalaciones compartidas,
que todos ustedes han apoyado generosamente en Gladstone.
Contamos con grandes colaboradores, incluyendo a Shinya,
desde su laboratorio en Gladstone, Benoit Bruneau, a quien ya mencioné,
Bruce Conklin y Sheng Ding,
quienes se nos unieron el año pasado desde el Instituto Scripps.
Muchas gracias a todos.