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Hola, soy *** McIntosh, profesor de Biología Celular de la Universidad de Colorado
en Boulder. Esta es la tercera de tres conferencias que voy a dar sobre el tema del movimiento
de los cromosomas. Esta vez voy a desarrollar la información que Uds. han visto
en las conferencias anteriores para hablar de este
problema particular de cómo los cromosomas se acercan a los polos
durante la anafase - el proceso llamado anafase A.
Anafase A es una parte esencial de la segregación cromosómica
en la mayoría de las células. Hay evidencia amplia a partir de los diferentes métodos experimentales
que la gente ha aplicado, y si han visto la conferencia anterior
tienen una pequeña idea de cuán amplio es
el paisaje experimental que la gente ha utilizado para tratar de entender los procesos de mitosis.
Esta charla que voy a dar ahora es
uno muy personal porque se va a basar en el trabajo reciente de nuestro laboratorio
y es, por supuesto, una perspectiva limitada.
Porque cualquier enfoque individual a un problema científico va a ver a sólo una parte
porque así se puede cavar lo suficientemente profundo para tratar de hacer algún progreso.
Sin embargo, espero que lo que voy a poder transmitir a Uds.
es la forma de utilizar diferentes
enfoques para llegar muy profundo y tal vez empezar a comprender
un proceso biológico fundamental.
Entonces, ¿cómo se acercan los cromosomas a los polos en anafase A?
Se han producido dos hipótesis importantes que han sido muy activas
en este campo por mucho tiempo. La hipótesis del motor, donde las enzimas,
por ejemplo la dineína de la que estábamos hablando la última vez
o una quinesina, podrían estar involucradas en la conducción de los cromosomas hacia los polos,
como un proceso de movilidad, tal como esos mismos motores mueven las vesículas
en las células, por ejemplo. Pero está claro, cuando nos fijamos en la mitosis,
que los microtúbulos deben acortarse durante la anafase A.
Eso es lo que significa acercarse a los polos, lo que ha dado lugar
a la hipótesis de despolimerización, que originalmente fue formulada por Gunnar Ostergren
allá por los años 40 y 50, y luego desarrollada por Shinya Inoue
a base de un trabajo hermoso que él hizo con microscopía de luz polarizada.
Yo estaba muy a favor de la hipótesis del motor durante gran parte de mi carrera
porque parecía una manera tan atractiva de pensar acerca de este complejo proceso móvil.
Pero lo que les voy a mostrar hoy es que he cambiado de bando y he llegado a creer
que la despolimerización podría estar en la raíz del movimiento de cromosomas.
Ahora, ¿cómo se prueba una hipótesis con un proceso tan complejo como la mitosis?
La manera obvia sería desactivar una proteína de motor de manera que crea problemas
para el proceso mitótico y se puede ver
cuáles son las formas en que los cromosomas se mueven o no se mueven
en circunstancias donde ya no tienen esta función motora en particular.
Lo que han visto varias personas
que han adoptado este enfoque ya sea genética o farmacológicamente
es que si se puede construir un huso y se puede colocar allí los cromosomas
para estudiar la anafase A,
entonces si se perturba el funcionamiento de un motor, se perturban aspectos de
la función del huso. Esta perturbación puede aparecer de varias formas:
puede aparecer en el hecho de que el huso no puede retener
su integridad estructural o puede aparecer en el hecho de que
si hay una manera de medir la frecuencia con que un cromosoma se pierde,
entonces los cromosomas se pierden con más frecuencia cuando el motor
no se encuentra. Lo notable, sin embargo, es que si vemos los datos que hay en la literatura,
muchos aspectos de la mitosis continúan incluso cuando un motor dado es perturbado.
Van un poco más lento, no todos los cromosomas pueden segregarse
correctamente, pero muchos de ellos lo hacen.
Y por supuesto, si uno está interesado en la importancia de su propio trabajo,
lo que quiere hacer si ha hecho una perturbación es verla causando un montón de problemas
y así enfatizar las cosas que no están funcionando.
Pero lo que he estado haciendo en mi propia mente y en el trabajo de nuestro laboratorio
es preguntar qué sigue sucediendo aun cuando los motores no están allí.
La manera en la que hemos hecho esto es mirar las células de levadura,
donde es posible hacer supresiones de genes con relativaa fácilidad
y demostrar que toda la pieza de ADN se ha ido de
la célula. Así que no hay posibilidad de que el motor, que es el producto
proteico de ese gen, esté contribuyendo al proceso mitótico
que Uds. están viendo. Entonces se puede preguntar: ¿qué pasa?
Hemos hecho esto en una célula de levadura de fisión utilizando
las técnicas moleculares típicas para eliminar
dos proteínas parecidas a kinesinas, cada una de las cuales es un extremo negativo en su actividad dirigida
y la cadena pesada de dineína, por lo que no hay más motores dirigidos por el extremo negativo
en esta célula, y ¿cómo lo sabemos?
Pues bien, el genoma de este organismo está secuenciado
y sabemos, según entendemos la función motora con los microtúbulos, que no queda ningún motor
en la célula y sin embargo, cuando les muestro
el movimiento de los polos y un cromosoma,
que hemos marcado con una etiqueta fluorescente cerca del cinetocoro,
este lapso de tiempo mostrará la separación de los polos del huso.
Se puede ver el cromosoma, que está aquí, y Uds lo verán
migrándose hacia el polo del huso
y se puede medir la velocidad a la que migra hacia el polo
a medida que se agrega al huso.
Ahora, por supuesto, debería bi-orientarse y llegar a la placa de metafase.
este cromosoma en particular llegó un poco tarde
y eso es común con estos cromosomas que carecen de varios motores, pero se puede
ver que realmente se segregó correctamente.
A partir de estos datos en bruto, hemos podido
medir la velocidad de la aproximación final de un cromosoma
al polo en una variedad de genotipos.
El tipo salvaje se muestra en amarillo
y luego un motor mutante tras otro y aquí abajo
en verde estamos viendo la deleción de los tres motores dirigidos al extremo negativo.
Sin embargo, esta aproximación final al polo
se está produciendo a una velocidad que no es diferente de la del tipo salvaje.
Así pues, estas células producen errores. No están sanas y que no podrían
sobrevivir en la naturaleza, y de hecho hemos medido la frecuencia de la pérdida del cromosoma
y ha subido hasta cientos de veces.
Así que éste no es un organismo sano, pero es
un organismo donde el movimiento de los cromosomas a los polos se produce a una velocidad que es
indistinguible de la del movimiento normal de cromosomas de tipo salvaje.
Esto significa que estos motores no son importantes para tal movimiento.
Pueden ser importantes para otras cosas, como adjuntar
los cromosomas al huso o
la segregación o la integridad del los polos
del huso, pero no para este fenómeno fundamental de la anafase A.
Entonces...bueno, primero que todo, podemos decir que esto no se debe simplemente a idiosincrasias
de la levadura de fisión; también es cierto en la levadura en ciernes,
donde el grupo Tanaka ha sido capaz de demostrar
esto con toda claridad. Por lo tanto, estos movimientos deben ser causados
por algo que está pasando en esta célula
que no es un motor dirigido al extremo negativo.
Podría ser algún componente no microtubular
del huso, pero esto no parece muy probable
porque aunque se ha identificado
actina en el huso, resulta que la actina no es generalmente
fibrosa cuando se encuentra en este huso.
También se han identificado matrices en el huso,
pero todavía no se sabe si estas matrices tienen alguna función cinética.
Podría ser entonces que se trata simplemente de la despolimerización de microtúbulos,
que en sí es un motor de alguna forma.
¿Cómo lo podemos averiguar?
Esta es una idea inverosímil y para convencer a alguien
realmente necesitamos alguna evidencia experimental sólida.
La inverosimilitud de esto me la describió mejor
el kineticista experto que estudió las enzimas de miosina y otras, Ed Taylor.
Era muy escéptico acerca de la hipótesis de desmontaje y
señaló que si fueras un escalador de roca suspendido en una cuerda
desde un precipicio y quisieras subir el acantilado, definitivamente no lo harías
cercenando la cuerda para hacerla más corta.
Esta analogía ciertamente pone en duda la hipótesis.
Pero lo que les voy a mostrar es que tiene cierta validez.
La polimerización de microtúbulos puede hacer un trabajo mecánico.
Esto se vio muy bien en el laboratorio de Hotani, hace muchos años,
donde pusieron tubulina soluble al interior de las vesículas lipídicas
y la indujeron a polimerizar
y la polimerización de la tubulina condujo estas deformaciones de la membrana lipídica,
mostrando que la polimerización podría hacer el trabajo.
En efecto, es bien sabido que la polimerización de actina puede hacer el trabajo
y Uds. deben ver el seminario iBio, que describe eso muy bien,
porque tiene una cantidad hermosa de detalles, todos mostrados por Julie Theriot.
Así que la polimerización es fácil de entender
como un motor, pero ¿qué pasa con la despolimerización?
Diseñamos un sistema experimental para ver esto
donde teníamos una lente objetiva en el microscopio y un cubreobjetos.
Estábamos mirando un objeto que era como nuestra
manifestación en vitro de un polo del huso.
Por coincidencia utilizamos un protozoo ciliado
que lisamos con un detergente para lavar la membrana y limpiar el citoplasma,
pero dejó atrás de lo que se llama una película
que cuenta con unos 500 cuerpos basales para flagelos.
Esa estructura ahora nucleará grandes números de microtúbulos.
Se utilizó la tubulina purificada del cerebro para entrar y conseguir este bosque de microtúbulos,
cuyos extremos positivos están apuntando lejos
del organizador, así como los extremos positivos de los microtúbulos del huso
están apuntando lejos del centrosoma.
Podríamos entonces introducir cromosomas que habíamos
parcialmente purificado a partir de células CHO y preguntar si se unen.
Y si se unen, ¿podemos hacer que se muevan?
En esta película que hizo Vivian Lombillo cuando era estudiante de posgrado
en el laboratorio, se puede ver un par de cromosomas que se encuentran atrapados en el bosque de microtúbulos
que ha crecido a partir de esta película.
Mientras avanza la película, ahora se introducirá un tampón
que no contiene tubulina, y se puede ver el cromosoma fluir inmediatamente aguas abajo
en el flujo del tampón. Esta película es en tiempo real, por lo que
no estamos exagerando la velocidad y la fuerza del flujo
es sustancial; y sin embargo, cuando los enfocamos,
vemos que los cromosomas siguen unidos.
Este tampón no contiene nucleótido trifosfato, ningún ATP, ningún GTP,
y de hecho contiene apirasa, una enzima que reduce la concentración de nucleótidos hasta más abajo del nivel nanomolar.
Sin embargo, estos cromosomas entran en esta estructura aquí mientras los microtúbulos se desarman
a velocidades que son altas incluso para el movimiento fisiológico de los cromosomas.
Así que este trabajo demuestra que la despolimerización de microtúbulos
sin actividad motora dependiente de ATP
puede mover cromosomas en un tubo de ensayo.
Por lo tanto, hemos visto que los cromosomas pueden acercarse a los polos
in vivo sin motores presentes en la célula
y pueden acercarse a este polo del huso aquí
cuando no había motores presentes y dimos a los cromosomas una fuerza para moverlos.
Por supuesto, todavía podría haber enzimas de motor
en los cinetocoros, pero esto no puede ser una actividad del motor dependiente de ATP.
por lo que interpretamos esto como una motilidad dependiente del desmontaje.
¿Cómo podría la despolimerización de una fibra causar movimiento?
Estas imágenes que son micrografías electrónicas
de microtúbulos hidratados congelados, tomadas por Eva y Mandelkow Eckhart
en colaboración con Ron Milligan, muestran cómo son los extremos de los microtúbulos durante la polimerización
Son bastante romos.
Por otro lado, los microtúbulos que se despolimerizan muestran
este enrollamiento característico de la punta de los microtúbulos,
donde una hebra de la tubulina, un protofilamento, está doblándose.
Esto parece ser un evento característico del proceso de desmontaje.
¿De dónde viene esto?
Bueno, se relaciona con el ciclo de la polimerización y despolimerización de la tubulina.
Para polimerizarse, tubulina está unida al GTP y
la molécula es más o menos recta y se adjunta a los extremos de los microtúbulos.
Pero los microtúbulos inician la actividad de la GTPasa de la tubulina,
es como un factor de activación de la GTPasa cuando se piensa en las proteínas G.
Por eso, la mayoría de la tubulina en los microtúbulos es la tubulina PIB.
La ironía es que la tubulina PIB no se polimeriza.
La tubulina PIB tiende a desmoronarse.
De hecho, a medida que colapsa, muestra esta curvatura
y la interpretación que han hecho
varios investigadores que trabajan con eso,
principalmente Eva Nogales, es que la molécula de tubulina en su estado de unión a GTP
tiende a ser más o menos recta, pero en el estado de unión a GDP
tiende a doblarse. Este doblamiento significa que cuando el PIB se encuentra en la pared del microtúbúlo,
está bajo tensión como resultado de sus interacciones con moléculas de tubulina vecinas,
que interactúan con ella por enlaces no covalentes.
Así que esa interacción mantiene la molécula restringida y recta,
a menos que no haya ningún tipo de tubulina de GTP
en el extremo para proporcionar rectitud.
Ahora, la curvatura de estos protofilamentos de tubulina es una relajación de la
molécula de tubulina PIB hasta su geometría de mínima energía.
Lo que esto significa es que un microtúbulo en el curso de la despolimerización
va a tener una ola de cambio conformacional.
Doug Koshland fue el primero en señalar que esta ola conformacional
podría ser una manera de empujar las cosas
y podría ayudar a tirar cromosomas al polo.
Pero, por supuesto, para aprovechar de eso, la célula debe encontrar alguna manera
de acoplarse a este microtúbulo para agarrarlo
y experimentar la fuerza de esos protofilamentos doblados.
Tenemos que entender cómo podría ser ese acoplador para ver cómo esta relajación
de la molécula de tubulina podría ser un golpe de poder que impulsaría el movimiento de cromosomas.
La primera indicación de lo que esto podría ser
provino de otro trabajo realizado por Vivian con ese sistema experimental que mostré anteriormente
con los cromosomas en movimiento in vitro.
Ella añadió anticuerpos para quinesina, primero una quinesina general,
y luego una quinesina que está específicamente localizada en cinetocoros,
llamada la proteína E del centrómero.
Esos anticuerpos causaron una reducción dramática
en el movimiento de los cromosomas de esta manera
dependiente de la despolimerización, lo que sugiere que un motor del cinetocoro
es importante para el movimiento dependiente de la despolimerización incluso cuando no hay ATP presente.
Pero recuerden la advertencia que planteé al final de la última conferencia,
que aun cuando se agregan anticuerpos monoespecíficos,
pueden tener efectos indirectos. Así que esto realmente no nos demuestra que esta molécula
sea un acoplador o que funcione de esta manera.
Es una prueba sugerente.
Hemos obtenido otras pruebas, sin embargo,
de que una enzima de motor dependiente de microtúbulos puede
funcionar como un acoplador con una quinesina-8 a partir de células de S. pombe.
Si esa quinesina está unida a una cuenta y la cuenta nteractúa con un microtúbulo
que no está visible aquí, pero se muestra en forma de diagrama allí,
y ahora inducimos a los microtúbulos
a desmontarse, entonces la cuenta es tirada por el desmontaje de microtúbulos,
tal como he mostrado en los otros experimentos
y estos gráficos muestran la velocidad y la trayectoria.
Es evidente que éste es un movimiento bastante procesivo,
en el sentido de que la cuenta sigue el extremo del microtúbulo en desmontaje por bastante distancia.
Así que una enzima de motor puede servir como un factor de acoplamiento independiente de ATP
para unir una carga a un microtúbulo en desmontaje.
¿Tiene que ser un motor? No.
Y uno de los descubrimientos recientes más notables en el campo de la mitosis
ha sido el descubrimiento de este complejo llamado ya sea Dam1 o DASH,
dependiendo del laboratorio con el que se asocia.
Las personas que primero descubrieron y nombraron la proteína Dam1
y poco a poco encontraron más y más proteínas que formaban parte de un complejo proteico grande
lo llaman el complejo Dam1. He colaborado con ese laboratorio,
así que voy a usar ese nombre, pero el nombre DASH se utiliza
en muchos otros laboratorios para el mismo complejo.
Se trata de un complejo inusual porque se trata de
diez polipéptidos distintos, todos
los cuales se ensamblan en un pequeño objeto en forma de pelota de fútbol americano
y esto se llama el complejo Dam1.
Y este complejo polimeriza con otros de su propia especie
y los polímeros forman anillos alrededor de los microtúbulos.
Aquí están los anillos que se forman sólo en la superficie de un soporte
visualizado en el microscopio electrónico mediante la tinción negativa.
Hay mucho trabajo realmente excelente, tanto en el grupo de Westermann donde Nogales
ha estado haciendo la microscopía electrónica
en su laboratorio y en el grupo que está en Cambridge, Massachussetts
a cargo de Steve Harrison ha sido...han proporcionado
pruebas expertas y excelentes de
la estructura de este complejo y la manera en la que
interactúa con los microtúbulos.
Hemos colaborado con el grupo de Berkeley
que incluía a Westermann y sus mentores, Georjana Barnes y David Drubin.
Con ellos también hemos podido purificar este complejo,
etiquetarlo con tinta fluorescente y permitirle interactuar con los microtúbulos
en nuestro sistema in vitro, donde ésta es la película que
han estado viendo,
y luego éstos son los complejos de la proteína Dam1,
que son fluorescentes. Así aparece
nuestro complejo Dam1 cuando rodea a los microtúbulos vistos
en el microscopio electrónico, pero por supuesto no se puede hacer experimentos cinéticos
en el microscopio electrónico. Así que vamos a hacer un experimento aquí
donde vemos lo que pasa con estos complejos Dam1
cuando causamos que los microtúbulos se desensamblan.
Aquí estamos ahora blanqueando la pequeña punta
que está al extremo del microtúbulo, y el microtúbulo
comienza a despolimerizarse, y se puede ver que el complejo Dam1
se mueve con los extremos del microtúbulo a medida que
se acortan. Por lo tanto el complejo Dam1
es también un acoplador que puede aprovechar de las estructuras
que se encuentran al extremo de los microtúbulos.
Este acoplador en realidad puede tirar de una carga, y
lo que hemos hecho aquí es poner el complejo Dam1
sobre una cuenta. Y esta cuenta ya se puede seguir
como un objeto que es una carga que el complejo Dam1
mueve mientras se asocia con los microtúbulos.
De nuevo, cuando inducimos el desmontaje de microtúbulos, mientras el desmontaje
llega a la cuenta, la cuenta detendrá su movimiento browniano
de ida y vuelta y comenzará un movimiento progresivo
hacia el origen de los microtúbulos, que es esa película que se sienta allí al lado.
Ahora bien, este tipo de trabajo nos permitió determinar que el complejo Dam1 parece
formar una variedad de estructuras, todas las cuales pueden interactuar con los microtúbulos.
Si adjuntamos Dam1 a una cuenta y no tenemos el complejo Dam1 en solución,
sino que simplemente permitimos que la cuenta se una a los microtúbulos,
se obtiene una distribución de las velocidades que se muestra aquí en rojo.
Si tenemos Dam1 en solución para que se forme un complejo que podría hacer esas
estructuras en forma de anillo que les mostré en el microscopio electrónico,
lo que vemos es que todavía se mueve la cuenta, pero el movimiento es más lento,
como si la formación del anillo en realidad pudiera retardar la velocidad del desmontaje de los microtúbulos.
Así que este proceso parece requerir un estudio detallado
y hemos hecho tantos experimentos que de ninguna manera voy a poder
describírselos todos en el transcurso de esta clase breve,
pero quiero mostrarles la herramienta que ha sido más importante para nosotros en
tratar de hacer este tipo de trabajo. Es un microscopio de luz estándar, que tiene
una cámara sensible en su parte superior.
Aquí tiene un par de láseres, uno de los cuales
es muy fuerte y puede ser conducido a través de un dispositivo que permite
dirigir el rayo láser. Arriba en el microscopio,
el otro láser que está allá es sólo para ayudarnos a alinear las cosas.
Así que un rayo láser pasa por nuestra lente objetiva
y esta luz muy brillante puede ser utilizada en lo que se llama una trampa óptica.
Es un dispositivo que nos deja agarrar un objeto pequeño
que refracta la luz, como una cuenta de vidrio o plástico.
En este lado, tenemos dos otros láseres, uno verde y uno azul,
que se utiliza para blanquear la fluorescencia
de algunas partes de nuestra muestra. Lo que
vamos a utilizar son trucos para
poder hacer experimentos con cuentas y preguntar:
¿se puede controlar la fuerza que se genera en este sistema?
Así que aquí está una vez más nuestra película sirviendo como nucleador:
microtúbulos creciendo a partir de tubulina purificada.
El problema es que estos microtúbulos tienen que ser lábiles.
Eso significa que si se diluye la preparación de
tubulina con cualquier otra cosa,
vamos a hacer que los microtúbulos se desarmen, por lo que necesitamos estabilizarlos.
Y lo hacemos poniendo una tapa en la
punta, donde polimerizamos la tubulina
en un análogo de GTP que no se hidroliza, o se hidroliza muy lentamente.
El resultado es que ahora tenemos microtúbulos estables,
así que podemos reducir la concentración de tubulina a cero y
ahora podemos introducir cuentas cubiertas con
algo que hará que se peguen al microtúbulo mismo.
La manera de hacer esto es que utilizamos tubulina biotinilada
y partículas cubiertas con la proteína avidina, por lo que la
conexión entre los microtúbulos y la partícula
es una de las interacciones no covalentes más fuertes conocidas en la biología.
Esto no va a ninguna parte, claramente no es
un motor y podemos preguntarnos: cuando desmonta los microtúbulos,
¿qué pasa? La manera en que hacemos este experimento es
activar la trampa láser para que esta luz láser brillante tome esa
cuenta y tengamos una forma de medir la posición del centro de la cuenta
muy precisamente. Luego prendemos nuestro láser de fotoblanqueo
para desactivar la tubulina que está allí, y la tapa se retira, y los microtúbulos
se desarman, y Uds. ven que recogí un poco
del movimiento de esa cuenta
mientras pasaba el desmontaje.
Ese es el tipo de evento que estamos buscando
para tener los motores completamente fuera de la ecuación
y preguntar: ¿puede el desmontaje de microtúbulos hacer el trabajo?
Y la respuesta es sí.
Aquí hay un dibujo de lo que pensamos que está sucediendo
con la partícula, dibujada muy pequeña en relación al microtúbulo,
y se puede ver el protofilamento doblado que podría
ejercer una fuerza sobre la partícula.
Se trata de una huella que se obtiene a partir de un dispositivo muy sensible
llamado un fotodetector cuadrante que nos permite
determinar la posición del centro de la
partícula con extremada exactitud, de un nanómetro o menos.
Todo este movimiento que se ve
aquí es el ruido térmico que la cuenta
oscila como resultado de sus interacciones con moléculas
en solución. Pero a medida que se produce el desmontaje,
la partícula es empujada un poco hacia los extremos negativos de los microtúbulos y luego es liberada.
Ahora está simplemente en el centro de la trampa y el microtúbulo
ha desaparecido. Ahora bien, si esto es realmente
una fuerza que se genera de esta manera, se podría imaginar que estamos tirando
aquí en el centro de la partícula con la trampa, y el radio de la cuenta
es como una palanca. Mientras más pequeña la partícula, menor nuestra ventaja mecánica
y mayor la fuerza que hay que generar. De hecho,
aquí se puede ver que con una partícula de 2 micras
vs. una partícula de 1 micra vs. una media micra
obtenemos fuerzas más grandes mientras la partícula se hace más pequeña,
lo que sugiere que éste es realmente el plegado del protofilamento
empujando la partícula para darnos la fuerza que estamos viendo.
¿Cuánta fuerza? No mucha,
con este sistema no fisiológico. Pero también suponemos que sólo estamos interactuando
con un lado de un microtúbulo, y si se piensa
en el complejo Dam1, que rodea los microtúbulos
como un anillo, uno podría imaginarse que Dam1 sentiría la fuerza de todos los protofilamentos doblados
a la vez, y nos daría mucha más fuerza.
Así que, naturalmente, hemos tratado de unir las partículas
al complejo Dam1. Aquí hay una micrografía verdadera
del complejo Dam1 sobre un microtúbulo, pero esto es sólo un dibujo
con las representaciones de los anticuerpos que se han unido a la partícula.
Estamos utilizando anticuerpos que interactúan con el complejo Dam1
y nos dan un buen vínculo fuerte, y ahora podemos preguntar: ¿qué vemos cuando sucede el desmontaje?
La respuesta es: una fuerza mucho más larga y fuerte.
Esta fuerza es ahora aproximadamente seis veces mayor que la fuerza que se observó
cuando sólo estábamos investigando un lado del microtúbulo.
Por eso, realmente parece que hay un anillo
rodeando el microtúbulo,
probando la acción de todos los protofilamentos
y produciendo una fuerza, la cual, una vez que hemos hecho correcciones
para el diámetro de la partícula, parece ser de 20, 30 o incluso 40 piconewtons.
Es una unidad de fuerza inusual para la mayoría de Uds.,
pero una molécula de quinesina o una molécula de dineína se desarrolla alrededor de los 5 piconewtons.
Así que un microtúbulo que interactúa con un anillo
es realmente poderoso. Es algo así como un bulldozer
y no es extraño que se puede eliminar los motores de la célula
y los cromosomas continuarán moviéndose, si éste sea el proceso que
realmente lo está haciendo. Entonces, ¿cómo funcionan las cosas?
Bueno, aquí están las dos hipótesis que son fundamentales para entender este movimiento
en este momento. A la izquierda se ve
un movimiento browniano, un paseo aleatorio por difusión de un anillo que se modela en estas simulaciones
realizadas por mi colega, Fazly Ataullakhanov y sus estudiantes en Moscú.
Ellos permiten la difusión que se produciría con un objeto
del tamaño del anillo y una unión suelta,
y esta difusión todavía puede dar lugar a un movimiento procesivo
debido a que la difusión está sesgada
por el desmontaje de los microtúbulos.
Aquí estamos mostrando un modelo diferente
y este es uno donde se presume que el anillo se une
fuertemente a la pared del microtúbulo, no covalentemente,
pero todavía estrechamente. A medida que estos protofilamentos
se doblan, tienen que forzar el anillo de una posición a la siguiente
a la siguiente, y se puede ver que el anillo de alguna manera se estanca
y luego sigue adelante y va más lejos de nuevo.
Esta es entonces una situación donde una caminata forzada
está causando la migración del anillo.
Ahora intuitivamente se podría pensar que esta difusión parcial es un sistema más eficiente
ya que no hay que gastar tanta fuerza en superar la energía
de la unión entre el anillo y el microtúbulo.
Pero esto tiene problemas porque la polimerización y despolimerización
de microtúbulos son eventos moleculares que ocurren
con fluctuaciones aleatorias. Así que de vez en cuando
la despolimerización pausa y los extremos de los microtúbulos presumiblemente
siguen derecho por un rato, y si hubiera una carga en este anillo, podría tirar y desprender
el extremo de los microtúbulos, lo que sería una catástrofe terrible
si estuviéramos tratando de mover los cromosomas por el desmontaje de microtúbulos.
Así que intuitivamente preferimos este modelo de unión fuerte
pero en realidad hay bastante evidencia de que
ése es el caso.
Entonces, ¿es el anillo Dam1 la respuesta
a cómo los cromosomas se acoplan a los microtúbulos?
En la levadura en ciernes, Dam1 está en el huso, que se une a la cromatina.
Es esencial para la segregación cromosómica correcta
y esto nos dice que el complejo Dam1 es un excelente candidato
para el acoplador de levadura en ciernes.
Curiosamente, en la levadura de fisión, ya no es esencial
en las células que de otro modo son de tipo silvestre.
Ahora bien, si empezamos a borrar los motores mitóticos,
entonces el complejo Dam1 se vuelve esencial
pero lo que tenemos aquí es una situación donde sólo al ir de
un hongo ascomiceto a otro,
hemos pasado de esencial contributivo.
Otra diferencia entre estos dos husos
es que en la levadura en ciernes hay un microtúbulo por cada cinetocoro
mientras que en la levadura de fisión hay 2 a 4 microtúbulos
por cinetocoro, así que tal vez el complejo Dam1
es absolutamente esencial cuando se necesita regular el desmontaje de los microtúbulos
tan fuertemente que el extremo del microtúbulo no se aleje del cinetocoro.
Pero cuando hay más microtúbulos
y se puede usar otros, ya no es un proceso esencial.
Lo que es aún más preocupante en términos de la generalidad del complejo Dam1
es que esta proteína no se ha encontrado aún fuera de los hongos.
Ahora bien, esto no quiere decir que otros anillos no se van a encontrar y se ha detectado
una serie de posibilidades porque el complejo Dam1 es tan atractivo
como una manera de hacer este trabajo. Así que muchos científicos creen que los anillos deben ser la respuesta
y están tratando de encontrar los componentes de los anillos
en otros tipos de células.
Hemos adoptado un enfoque diferente, que es
ir a ver la conexión entre los microtúbulos y el cinetocoro
con las mejores herramientas estructurales
que están disponibles y preguntar qué hay allí.
Hemos hecho esto utilizando
la tomografía electrónica. Ahora bien, ésta es una micrografía electrónica
de un cromosoma y un huso de fibra, aunque es muy poco atractivo
porque es una de varias imágenes
de una serie de inclinación donde ahora tenemos una muestra gruesa de
unos 300 o 400 nanómetros de grosor
en el microscopio electrónico.
Estamos recopilando imágenes a intervalos de 1 grado desde los +70º hasta los -70º
y luego hacemos una inclinación alrededor del eje ortogonal
para recoger muchos
puntos de vista de este objeto tridimensional.
Estos se pueden combinar por una variedad de enfoques matemáticos
para crear lo que se llama un tomograma, o una reconstrucción en 3 dimensiones de todo el material
que estaba en esa región que estábamos visualizando.
La cromatina aquí abajo. El cinetocoro aquí.
Los microtúbulos allí y Uds. pueden ver los extremos romos
en las puntas de muchos de los microtúbulos en esta matriz.
Luego podemos utilizar el software para sacar una sola
sección de nuestra reconstrucción tridimensional
que contiene los ejes de uno o más
microtúbulos, para que podamos ver exactamente cómo son estos extremos.
Estos extremos son de algún modo unidos al cromosoma,
y lo que queremos saber es cómo.
Al simplemente tomar un enfoque descriptivo,
podemos tratar de entender esto y la tomografía permite una forma completamente novedosa de ver esto.
Lo que voy a mostrar ahora es una serie
de imágenes en las que tomé un plano
que contenía el eje del microtúbulo y luego
voy a girar ese plano en torno al eje del microtúbulo
de modo que podemos visualizar un microtúbulo individual de orientaciones múltiples.
Uds. pueden ver el ir y venir de los protofilamentos acampanados.
Hay uno acampanándose aquí arriba, aquí hay otro bajando.
Todas estas son imágenes en diferentes orientaciones.
Podemos extraer esta información estructural
como una serie de gráficos, lo que nos permitirá entonces ver
una representación de los protofilamentos y su
acampanación en el extremo del cinetocoro de un microtúbulo.
Esto nos ha permitido cuantificar
exactamente la forma de estas acampanaciones según
la precisión de nuestros métodos para preservar
esta muestra y también nos ha permitido preguntar: ¿qué está conectado
a las acampanaciones? Bueno, en primer lugar,
observamos las acampanaciones de los protofilamentos de los microtúbulos con cinetocoros
aquí y de los microtúbulos sin cinetocoros allí,
y luego los comparamos con microtúbulos que están despolimerizándose y polimerizándose
in vitro, lo cual se visualiza en ese estudio que les mostré antes
de los Mandelkow y Ron Milligan.
Lo que se puede ver es que existe una enorme gama en la estructura del protofilamento
de microtúbulos con y sin cinetocoros.
Están de alguna manera entre el montaje y el desmontaje,
y esto era muy difícil de entender. Sin embargo, lo que hemos
hecho es centrarnos en los protofilamentos doblados, que son
un grupo intermedio. Lo que podemos ver
es que muchos de ellos tienen pequeños filamentos que conectan
el propio protofilamento arriba con en la región de la cromatina.
Luego, en la mitad inferior de la diapositiva, lo que he hecho es
poner gráficos para mostrarles
lo que creo que son los protofilamentos mismos
y estas fibrillas pequeñas que están conectadas a los protofilamantos y conectadas también
arriba en la cromatina. Estamos llamándolas
fibrillas del cinetocoro, por razones obvias.
El problema es que esta imagenología se encuentra justo en el límite
de la metodología, ambas pueden conservar la muestra
bien porque estamos mirando una célula entera aquí, que ha sido preparado para la microscopía electrónica
y la resolución de la imagenelogía de los métodos
que estamos utilizando, la tomografía de estas muestras gruesas.
Sería muy bueno si pudiéramos promediar las cosas para tratar de ver
si existe una estructura promediada para la fibrilla.
En el laboratorio Katya Grishchuk tenía la intuición de que si pudiéramos
tomar las clases intermedias de protofilamentos,
en el medio de polimerización y despolimerización,
y mira sólo esto, podríamos ver algo especial
porque éstos no están simplemente despolimerizándose.
Así que los tomamos, los ordenamos objetivamente, simplemente a base de su inclinación cerca de la pared del microtúbulo
Así podríamos tener cuarenta o cincuenta de tales
protofilamentos a partir de los datos originales de la imagenología y promediarlos todos.
Este es el promedio para un microtúbulo sin cinetocoro.
Este es un microtúbulo con cinetocoro en metafase
de ese grupo intermedio, y creo que se puede
ver ahora que hay una fibra muy respetable que se promedia
de estos más o menos 50 conjuntos de datos.
Esto también se encuentra en la anafase, donde la acampanación es ligeramente más larga
en este protofilamento, mientras que el grupo de los cuernos de carnero, los que tienen la curvatura grande
característica de la despolimerización,
no tienen tales filamentos asociados que
se promediarían de esta manera. Lo que esto sugiere es que
si eliges tus protofilamentos por un criterio objetivo
que indica que están bajo algún tipo de estrés o tensión
que les impide ser como la despolimerización
y entonces no se polimerizan, puedes
luego encontrar protofilamentos que están allí.
Nuestra interpretación de esto es que
estas fibrillas del cinetocoro están ejerciendo fuerza sobre
los protofilamentos doblados para que cuando los protofilamentos intentan doblar, estiren esta fibra
y ejerzan tensión en el cromosoma mismo.
Así que éste es otro tipo de acoplamiento,
uno que no implica anillos,
uno que no tiene que ser un motor, pero que podría ser simplemente un enlace estático de algún tipo.
Aquí hay un dibujo donde he representado
protofilamentos a base de los trazados que he
hecho de los propios microtúbulos,
protofilamentos, lo siento, las fibrillas del cinetocoro
que conectan los protofilamentos arriba en la cromatina.
Esta es una simulación realizada por Grishchuk, Ataullakhanov y sus estudiantes.
Muestra que incluso con una carga
de alrededor de 40 piconewtons tirando de esta manera,
si tenemos fibrillas de cinetocoro fuertemente unidas
que interactúan con la tubulina polimérica y
se adherirán a estos protofilamentos doblados, pero se librarán
tan pronto como la tubulina se caiga del extremo,
entonces se puede hacer un motor de avance que funciona perfectamente bien.
De hecho, algunos de los detalles de este motor, que ahora
se describen en el artículo de Cell que salió este año,
nos dan la confianza de que esto tiene propiedades ventajosas
y que puede ser incluso mejor que un anillo para el acoplamiento
a pesar de que es una idea improbable.
Estructuralmente entonces, las fibrillas se encuentran en muchos lugares, pero
nos gustaría saber de qué están hechas.
Si no conocemos la composición proteica de estas
estructuras, es muy difícil hacer experimentos que
nos digan cosas definitivas sobre el mecanismo.
Tenemos una serie de ideas de lo que podría ser,
por supuesto, porque hemos visto
que los motores relacionados a los cinetocoros, como las quinesinas 7 y 8,
son fibrosas en su estructura y pueden hacer la
tarea del acoplamiento. Hay también proteínas sin motores,
que son fibrosas y se localizan
en el cinetocoro. Ndc80 es tal vez la más atractiva de todas
porque se encuentra en todas las células donde se ha buscado,
y en todas las células donde dichos experimentos se han hecho,
y si se elimina este motor, los cromosomas simplemente no se pueden conectar al eje.
Así que Ndc80 es una molécula fibrosa importante implicada en
adjuntar los cromosomas a las fibras del huso.
Bien podría ser parte de esta maquinaria de unión.
Pero la evidencia que existe ahora sobre Ndc80 muestra que se une a la parte exterior de los microtúbulos
y de la forma en que les he mostrado con las fibrillas, con la curvatura de los protofilamentos,
casi parece como si la fibrilla se adhiriera al interior de los microtúbulos.
Hay muy pocos estudios que han identificado proteínas que se unen a la parte interior
de un microtúbulo, así que quizás Ndc80 también tiene esta función, o podría
haber una nueva clase de proteínas aún no identificada
que puede desempeñar esta función.
O, alternativamente, nuestra resolución podría no ser suficiente para dar
la respuesta directa en cuanto a dónde las fibrillas de se unen a los protofilamentos.
Podrían ir al lado lejano y unirse allí.
Ciertamente hay otras proteínas fibrosas en el huso. Hay muchas
en el cinetocoro, por lo que algunas de éstas pueden servir como conectores.
La naturaleza molecular de este acoplamiento es realmente algo que uno quiere entender.
Pero en realidad no se conoce todavía.
La evidencia de la localización de proteínas,
de interrupciones genéticas de componentes particulares
de la bioquímica, todos estos diferentes
tipos de experimentos sugieren que hay múltiples factores
que se involucran en el acoplamiento de los cromosomas a los microtúbulos.
Algunos más importantes que otros tal vez, como Ndc80,
pero puede ser que lo que visualizamos en el microscopio electrónico
es en realidad un pequeño zoológico molecular
y hay múltiples tipos de conexiones realizadas por los diferentes componentes.
El hecho es que éste es un maravilloso conjunto de problemas no resueltos,
y es un maravilloso estudio o un problema para el trabajo futuro.
Es una situación donde uno espera que muchos laboratorios vengan participar
en este tipo de investigación, para contribuir
al conocimiento que tenemos, ya que nuestro grupo ha sido pequeño.
Estamos entusiasmados con nuestro trabajo.
Hemos disfrutado de las cosas que hemos hecho,
como se puede ver por el entusiasmo de Katya
y Fazly Ataullakhanov, el matemático que ha sido responsable
de la supervisión de estos tres matemáticos,
que también se están convirtiendo en biólogos celulares ahora.
Lo hemos pasado muy bien haciendo este trabajo
pero hay mucho que hacer, y esperamos que Uds. y otros vengan y se unan a nosotros en esta investigación.
Gracias. Adiós.