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Mi nombre es Jack Szostak.
Soy profesor de Genética en la Facultad de Medicina de Harvard,
investigador en el Hospital General de Massachusetts,
donde está mi laboratorio,
e investigador del Instituto Médico Howard Hughes.
En esta parte de mi conferencia,
Me gustaría concentrarme en un aspecto del origen de la vida celular,
que es la química de copiar plantillas de ácido nucleico que se replican.
Vamos a empezar mirando nuestra versión esquemática
de cómo nos imaginamos una protocélula simple,
así que de nuevo tenemos un sistema de dos componentes:
una membrana de célula primitiva encapsulando unas
moléculas genéticas, podrían ser ARN, podrían ser ADN,
podrían ser algo relacionado.
En la conferencia anterior
vimos el crecimiento y la división
del compartimiento de la membrana,
y en esta ocasión queremos centrarnos en la copia de
plantillas para hacer un producto doble:
la separación de las hebras
y su copia en una ronda subsiguiente
para que se pueda distribuir esa información a las células hijas.
Este es un aspecto fundamental de la
emergencia de la evolución darwiniana.
Hay una especie de polímero informativo
para codificar funciones hereditarias,
podría ser cualquier cosa que sea útil para la célula,
algo que ayude a que crezca,
algo que le ayude a dividirse,
algo que le ayude a sobrevivir mejor en su entorno,
casi cualquier cosa.
Pero necesitamos una manera en que esa función
se codifique y se transmita de generación en generación.
Ahora, hay dos formas generales
de pensar en el proceso de replicación de los ácidos nucleicos:
La primera sería una especie de proceso enzimático o catalítico.
El ejemplo clásico de eso sería una replicasa de ARN,
una molécula de ARN que es una ARN polimerasa
lo suficientemente buena para copiar su propia secuencia.
Trabajé en eso durante varios años.
Mucha gente ha seguido ese trabajo
y se ha avanzado mucho.
Creo que con el tiempo tendremos moléculas
que pueden hacer eso, pero en la actualidad
aún estamos lejos de una solución.
Y eso nos ha llevado a replantear el proceso
y dar un paso atrás y mirar los procesos químicos
que podrían dar lugar a la replicación de plantillas de ácidos nucleicos,
ya sea ARN o alguna molécula relacionada.
Así que ése será el foco principal:
los procesos químicos que conducen a la copia eficiente
y la reproducción de las plantillas.
Ahora, hay dos factores muy importantes que se aplican
en cualquiera de tales sistemas: tanto la
tasa de reproducción como la precisión, la fidelidad
de la copia tienen que exceder los umbrales críticos.
Por lo tanto, la tasa de replicación tiene que ser más rápida
que la tasa de degradación, y con una molécula
como ARN, que es un factor muy importante,
porque el ARN es un polímero muy delicado,
se hidroliza de forma relativamente rápida.
Esto impone un límite más bajo al nivel aceptable
de replicación. Además,
la fidelidad de ese proceso tiene que exceder el
umbral de error de Eigen. Si queremos propagar
información útil de generación en generación,
la precisión de ese proceso de copia
tiene que superar un umbral,
que está básicamente relacionado con el recíproco del
número de nucleótidos importantes para cualquier
función de la que hablemos.
En términos prácticos, eso significa que probablemente
tenemos que pensar en precisión o, digamos,
tasas de error de un porcentaje pequeño.
Los procesos químicos típicos que estudiamos ahora,
las tasas de error están en el rango de 5 %-10 % o 15 %,
así que se requiere una cierta mejora.
Y también nos gustaría ver mejoras
en la tasa de replicación, por lo que no podemos hacer estos
experimentos en un plazo razonable de laboratorio.
Por lo tanto, los elementos básicos que vamos a utilizar
para estos experimentos son muy diferentes
de los nucleósidos de trifosfato que se utilizan en todas las células modernas.
Así que estos son sustratos modernos.
Son cinéticamente atrapados en un estado de alta energía
por lo que requieren catalizadores muy sofisticados,
enzimas que pueden conferir la aceleración de 1012
que se necesita para hacer un uso eficaz de este tipo de sustrato.
También están, como he mencionado antes,
altamente cargados por el grupo de trifosfato,
que les impide fugarse de las células,
que es bueno para las células modernas
pero malo para las células primitivas,
que requieren que sus sustratos vengan
del medio ambiente y atraviesen la membrana de forma espontánea.
Eso significa que nos gustaría pensar en sustratos menos polares.
Eso nos lleva a pensar en moléculas
similares que se pueden ver aquí.
Estos son fosforimidazolides nucleósidos.
Estos tipos de moléculas fueron sintetizados por primera vez por Leslie Orgel
y sus alumnos y colegas,
y fueron estudiados con mucha profundidad en los 70, 80 y 90.
Estas moléculas son mucho más reactivas químicamente,
tenemos un grupo saliente mucho mejor,
por lo que son intrínsecamente más reactivas.
Se pueden polimerizar espontáneamente y copiar plantillas
sin enzimas y son también menos polares,
lo que significa que pueden cruzar membranas
mucho más rápidamente, sin ningún tipo de maquinaria de transporte
que se invoque. Así que los primeros trabajos de Orgel
y sus colegas nos acercaron un poco a los sistemas de copiado,
pero se toparon con una serie de problemas,
a los que vamos a llegar y tratar de ver individualmente.
Pero en primer lugar quiero retroceder un poco y
pensar acerca de cómo las moléculas de este tipo
habrían sido generadas en la Tierra primitiva.
Ese es un problema muy importante.
Sigue siendo un área importante de investigación,
pero creo que recientemente se ha hecho un progreso muy estimulante.
En los primeros días,
había procesos de autoensamblaje que fueron
descubiertos y que parecían sugerir que
la solución podría ser muy sencilla.
De hecho, la reacción de la formosa clásica, que se remonta a Butlerov,
mostró que se podía producir azúcares mediante la polimerización de formaldehído.
Por ejemplo, la ribosa puede ser vista como
un oligómero de formaldehído.
Cinco moléculas de formaldehído pueden auto-ensamblarse
en una serie de pasos para producir la ribosa.
El problema es hacer sólo ribosa.
De hecho, en este tipo de química,
normalmente se termina con decenas o
incluso cientos de productos.
Por lo tanto, parte del problema que ha intrigado a la gente
ha sido cómo hacer el azúcar correcto.
Hay un problema similar si pensamos en las nucleobases.
Desde el principio, Juan Oro hizo experimentos muy dramáticos
mostrando que podía hacer adenina de cianuro.
Simplemente hervir una solución de cianuro nos da adenina,
junto con un montón de otros productos.
Pero es muy llamativo que la adenina se pueda ver
como un pentámero de cianuro de hidrógeno.
Así que tenemos el mismo problema de cómo conseguir sólo los
bloques de construcción que queremos (A, G, C y U),
a diferencia de todos los otros heterociclos relacionados
que salen de este tipo de química.
Ahora, cuando gente como Orgel y muchos de sus colegas
comenzaron a mirar a la síntesis de pirimidinas,
parecía superficialmente muy fácil.
Por ejemplo, una citosina puede ser considerada como el producto
de la reacción de cianoacetileno y urea.
De hecho, hay variaciones en esta química
que son extremadamente eficientes .
Así que parecía que se podía hacer azúcares,
que se podía hacer nucleobases,
tal vez realmente resultaría fácil
hacer nucleósidos y nucleótidos
y llegar hasta el ARN.
Sin embargo, resultó que hubo un problema importante,
incluso al margen del problema de hacer sólo las moléculas que queremos.
Si pudieras tener ribosa y, por ejemplo, citosina,
tendrías que unirlas haciendo
el enlace glicosídico que las junta,
pero esa química básicamente no funciona.
A pesar de los esfuerzos de la gente,
esto fue un obstáculo durante un largo tiempo.
Así que uno de los avances más emocionantes en la química prebiótica
en los últimos años ha llegado desde el laboratorio de John Sutherland
en el Reino Unido. Él básicamente siguió
el trabajo anterior de varios otros laboratorios
y puso de manifiesto que existe una vía alternativa
que puede llegar hasta el producto final
sin tener que hacer este particular
enlace glicosídico mediante la unión de una base y un azúcar.
La solución básicamente viene de hacer este intermedio,
2-aminooxazol, a partir de cianamida y glicolaldehído.
En una serie de pasos muy simples y de hecho notablemente eficientes,
este intermedio puede ser elaborado en citosina ,
y luego la desaminación puede darnos la U.
Así que parece que podría haber una vía razonable
para por lo menos llegar a los nucleósidos de pirimidina.
La síntesis de los nucleósidos de purina
por una vía análoga
es un tema de investigación activo.
Si resulta que hay una vía similarmente eficiente,
eso sin duda será muy satisfactorio en el sentido
de proporcionar una química muy eficiente y específica para una región.
que nos da un conjunto restringido de bloques de construcción
que conducen al ARN.
Ahora, todavía hay muchas lagunas en nuestra comprensión
de cómo haríamos materiales de comienzo puros, concentrados.
Hay algunos pasos que conducen a los nucleótidos activados
que no están muy claros.
Así que hay mucho trabajo por hacer,
pero creo que esta nueva química realmente ha avanzado mucho el campo.
Por lo tanto, saltemos los enlaces que faltan por el momento
y supongamos que podemos hacer nucleótidos activados.
El siguiente problema en que tenemos que pensar es:
¿hay polimerización en las cadenas de ARN
y cómo podría suceder eso?
Bueno, aquí estamos en una buena situación
porque en realidad tenemos dos soluciones al problema.
La primera es la constatación de Jim Ferris y sus colegas,
incluyendo a Leslie Orgel.
Es el hallazgo de que un mineral de la arcilla común,
la montmorillonita, ilustrada aquí,
es un catalizador muy eficaz para ese
tipo de polimerización.
Este mineral de arcilla es un hidróxido de capas,
aluminosilicato, y entre las capas
hay moléculas de agua.
Las moléculas orgánicas también tienden a acumularse
en las capas internas del mineral de arcilla,
y a medida que se acumulan allí y se concentran
y se orientan en relación al otro,
su polimerización es catalizada.
Lo bueno es que ésta no es la única forma de hacerlo.
Se puede obtener esencialmente el mismo resultado
simplemente al tonar una solución de estos nucleótidos activados,
estos fosforimidazolides.
Como es una solución diluída a temperatura ambiente,
casi no pasa nada, no se polimerizan.
Pero si se pone la solución en el congelador
y se permite que el agua se congela y genere cristales de hielo,
lo que se ve es que los solutos, incluyendo estos nucleótidos,
se concentran en capas delgadas entre los cristales de hielo.
Cuando las moléculas están tan concentradas,
incluso a baja temperatura, pueden empezar a reaccionar unas con otras,
y se verá la formación espontánea de largas cadenas de ARN
como resultado de la congelación.
Así que esto es muy bonito
porque ahora tenemos dos escenarios naturales plausibles
donde un mineral común o simplemente el proceso de congelación
podrían generar cadenas de ARN.
Así que el siguiente problema que tenemos que enfrentar,
suponiendo que podemos hacer grupos de
polímeros de ARN esencialmente aleatorios, es cómo podrían ser copiados.
Aquí es donde nos encontramos con una nueva serie de dificultades.
Bueno, la copia parcial de plantillas de ARN
se conoce desde hace décadas, como he dicho,
por la obra de Leslie Orgel y sus colegas.
Aquí hay un ejemplo de ese tipo de química,
realizada por David Horning cuando era un estudiante de pregrado en mi laboratorio.
Comenzamos con un sustrato aquí, un nucleósido de guanosina,
activado como un fosforimidazolide,
y entregamos eso a un complejo de plantillas y partidores
donde la plantilla contiene una región de Cs
donde el nucleósido G puede unirse y provocar la extensión del partidor.
Así que aquí estaría el material de partida
y luego con el tiempo queremos ver
la incorporación de Gs para alargar el partidor.
Ese proceso se muestra aquí en el curso del tiempo:
comenzamos con sólo el partidor
y luego durante las primeras, digamos, seis horas,
observamos la incorporación del primer nucleótido,
y luego al día siguiente o subsiguiente,
vemos entrar el segundo nucleótido,
pero incluso después de dos días hay muy poco del tercer nucleótido.
Así que eso ilustra el primer problema:
este proceso es intrínsecamente más bien lento.
Y puesto que esta química requiere
una muy alta concentración de magnesio
para catalizar la reacción,
esta tasa de síntesis está en la misma escala de tiempo
que la tasa de degradación de la plantilla de ARN.
Así que eso es un problema.
Hay otros problemas, como se puede ver,
en la estructura del ribonucleótido:
hay dos hidroxilos sobre el azúcar
y cualquiera de ellos puede reaccionar para generar
la articulación correcta 3' - 5 ' o la incorrecta 2' - 5'.
Eso significa que inevitablemente se obtiene una mezcla de enlaces,
algunos de los cuales son el enlace natural y correcto del ARN
y otros no lo son.
La siguiente diapositiva resume los numerosos problemas
o problemas que deben ser resueltos si alguna vez
pensemos en un proceso químico completo para la replicación del ARN.
Así que comenzamos con estos problemas de la tasa y la fidelidad.
La fidelidad está en realidad estrechamente relacionada con el problema de la tasa.
Resulta que cuando se comete un error
en la incorporación de un nucleótido, o sea cuando una cadena está creciendo
se introduce la base equivocada, una pareja equivocada,
entonces,la adición de la siguiente base puede ser dramáticamente más lenta.
Llamamos esto el efecto de estancamiento
y por eso se ralentiza la tasa global de la síntesis.
Si pudiéramos hacer esa química más precisa,
la tasa de síntesis sería mucho mejor.
Ahí está el problema de la especificidad de región que he mencionado,
enlaces de 2' versus 3'.
Hay un problema si necesitamos
concentraciones muy altas de estos monómeros.
Al parecer, tienen que ser muy puros,
así que si tenemos otros tipos de nucleótidos ahí, digamos
con azúcares diferentes o una estereoquímica diferente,
ellos también se incorporan
y eso crea un lío en el producto final.
Además, estos monómeros, cuando están activados como imidazolidas,
son bastante inestables, son muy susceptibles
a la hidrólisis o la ciclación, las cuales son reacciones secundarias no deseadas.
Podrían ser resueltos si tuviéramos la química adecuada
para reintroducir el estado activado,
pero eso es algo que falta hasta el momento.
El requisito de una muy alta concentración de magnesio
es extremadamente problemático, tanto porque es
geoquímicamente poco realista como porque conduce a la hidrólisis del ARN.
Hay otro problema con el ARN:
incluso si se pudiera replicar una hebra de cualquier longitud significativa,
la temperatura de fusión del dúplex que es tan alta
que es casi imposible separar las hebras.
Térmicamente, se hace imposible fusionarlas.
Incluso si se pudiera fusionarlas,
las hebras volverían a estar juntas muy rápidamente.
Esta tasa de reasociación rápida es algo que
competirá con la química mucho más lenta de la copia de plantillas,
por lo que éste es otro problema que debe ser resuelto.
Finalmente, en nuestros experimentos
usamos partidores y los vemos crecer
simplemente porque eso es ***íticamente muy fácil de hacer,
pero por supuesto no había partidores en la Tierra primitiva,
por lo que tenemos que pensar en un proceso independiente de partidores
para copiar plantillas.
Así que todos estos problemas juntos han hecho que sea muy difícil
pensar en una vía plausible
para la replicación global de plantillas de ARN .
Por lo tanto, lo que decidimos hacer fue esencialmente dejar
esto y pensar en otros polímeros;
tal vez sería más fácil replicar otra cosa.
Y en el proceso de averiguar eso,
tal vez podríamos obtener pistas que nos permitirían volver
al ARN y pensar en cómo resolver algunos de estos problemas.
Ahora, de hecho, Leslie Orgel concluyó hace un par de décadas
que a pesar de que la replicación del ARN se veía muy difícil,
pensaba que la replicación de algún tipo de
polímero informativo se lograría con bastante facilidad
y que en el proceso de hacer eso
aprenderíamos algo de la replicación del ARN
o de cómo replicar algo que podría ser
relevante para el origen de la vida.
Ahora, por desgracia, a pesar de ese reto
a la comunidad química, pocas personas se han ocupado
del problema y todavía no existe un ejemplo
de la replicación química de ningún polímero informativo.
Así que creo que éste es un gran desafío.
Es una cosa muy interesante y divertida para investigar.
Esto es realmente el centro de una gran parte de nuestra atención
en este momento. ¿Qué podemos ver?
¿Cuáles serían otros ácidos nucleicos interesantes?
Entonces, lo que voy a hacer es simplemente mostrar varios
tipos de moléculas que hemos estado estudiando en mi laboratorio
en el último par de años.
Nos estamos concentrando en
polímeros genéticos con enlaces de fosforamidato:
éstos tienen enlaces de nitrógeno-fósforo
en lugar del enlace oxígeno-fósforo que se ve
en fosfodiésteres normales.
La razón de ello es que los bloques de construcción, los monómeros
para fabricar estos polímeros, son aminoazúcares,
así que ahora tenemos un grupo nucleófilo mejor que uno de hidroxilo,
lo que acelera la química de nuevo
y nos da un nuevo aumento en la tasa.
Por lo tanto, aquí hay tres redes troncales de fosforamidato.
Aquí hay una red troncal acíclica, de cadena abierta,
con esencialmente una estructura de ácido nucleico de glicerol.
Aquí hay un polímero con un enlace de 2' -5',
la versión fosforamidato del ADN,
con enlaces en 2'.
Y aquí está la molécula más cercana al ADN.
Todo lo que se ha hecho es cambiar el átomo normal de oxígeno
aquí a un grupo NH,
por lo que éste es el ADN de fosforamidato.
También hay otras dos moléculas que han capturado
nuestra atención recientemente, y éstas moléculas
son algo más restringidas conformacionalmente.
Así que ésta es la versión fosforamidato de TAN,
treosa ácido nucleico;
aquí el azúcar es un azúcar de cuatro carbonos, treosa.
Y aquí tenemos enlaces a 2 '.
Estas moléculas fueron hechas y estudiadas por primera vez en el Grupo Eschenmoser
Están en perfecto estado los sistemas de apareamiento de bases.
Finalmente, aquí se ve un esqueleto morfolino,
otra columna vertebral conformacionalmente restringida.
Así que en el caso de la treosa,
la restricción conformacional viene del hecho
de que sólo hay cinco átomos en la unidad de repetición de la columna vertebral,
así que hay un enlace rotable menos,
por lo que es entrópicamente limitado.
Aquí la restricción es diferente.
Esto proviene del hecho de que tenemos el
anillo morfolino de seis miembros,
al que le gusta sentarse en la conformación de silla,
por lo que es conformacionalmente restringido
de una manera muy diferente.
Por lo tanto, lo que hemos tratado de hacer es
estudiar sistemáticamente todos estos diferentes tipos de plantillas
para ver si podemos aprender algo de este proceso que podría
finalmente retroalimentarnso y enseñarnos acerca de la replicación del ARN.
Por lo tanto, en esta etapa, estamos realmente muy involucrados
en estudiar la copia de estas plantillas.
En muchos casos,
esto es en realidad muy difícil de preparar sintéticamente,
por lo que requiere mucho tiempo y esfuerzo.
Pero les voy a mostrar lo que hemos hecho hasta ahora.
Empezamos estudiando la plantilla más simple
desde un punto de vista estructural:
ésta es la columna vertebral del ácido nucleico glicerol.
Así que no hay azúcar cíclico, sólo un esqueleto de cadena abierta.
Y aquí está el monómero correspondiente.
Así que tenemos el nucleófilo de amino,
tenemos el fosfato activado.
Éstos se ven muy simple desde el punto de vista estructural,
pero de hecho hay un gran problema:
Esa falta de restricción del azúcar cíclico
significa que el nucleófilo de amino
puede alcanzar directamente el electrófilo de fósforo,
y como resultado el monómero activado se cicla
para dar este producto inútil aquí más rápido de lo que podemos medir.
Así que eso nos dice de inmediato que este sistema no es
químicamente un buen sistema para mirar
en términos de la replicación.
Sin embargo, la velocidad de esta reacción en realidad nos dijo
algo bastante interesante, y es que
la química intrínseca puede ser muy rápida.
Por lo tanto, si podemos colocar el nucleófilo
en la posición y orientación correctas
en relación con el electrófilo,
la polimerización en principio podría ir muy rápido,
incluso sin un catalizador externo.
El sistema que en realidad más hemos
estudiado hasta el momento y del que más hemos aprendido
es la versión fosforamidato del ADN con enlaces 2'-5'.
Aquí está el polímero.
Una serie de enlaces 2'-5' de fosforamidato,
y aquí está el monómero correspondiente,
se muestra como la versión del nucleósido G, pero un nucleófilo de amino.
Phosphorimidazolide, asi que un buen grupo saliente, un buen nucleófilo...
debemos obtener una química de polimerización muy rápida.
De hecho, eso es exactamente lo que hemos observado.
En nuestros primeros experimentos, después de que aprendimos a hacer
estas moléculas, se establecieron los siguientes sistemas,
donde tenemos un complejo de plantillas de partidores.
La plantilla contiene esta región de Cs,
donde los monómeros G pueden unirse,
y a continuación se puede observar que el partidor es
alargado por la incorporación secuencial de los
múltiples residuos G.
El resultado experimental se muestra aquí.
Comenzamos con el partidor, y en el transcurso de las horas,
podemos ver la copia completa de la plantilla
y la acumulación de la longitud completa, el partidor extendido.
Así que esta reacción es tan eficiente que, creo,
si no supiéramos que esto es sólo química,
se podría pensar que es una reacción catalizada enzimáticamente,
pero no hay ninguna enzima, no hay polimerasa,
esto es sólo la química intrínseca de nucleótidos activados
que se unen a una plantilla y extienden un partidor.
Por lo tanto, si pudiéramos hacer esto de una manera más general,
copiando plantillas de secuencia arbitraria,
básicamente tendríamos el tipo de sistema que queremos.
Seríamos capaces de copiar secuencias
que podrían llevar a cabo las tareas funcionales.
Una de las cosas buenas de este sistema en general es que,
a causa de los enlaces 2'-5',
el dúplex que se forma tiene una temperatura de fundición relativamente baja.
Es relativamente fácil separar térmicamente los filamentos
y podríamos imaginar un ciclo de pasos completos
de copia y replicación completa.
Bueno, por desgracia, las cosas no son tan simples.
Esta química de copiado funciona muy bien
con las plantillas C que conducen a la incorporación de T,
funciona muy bien con las plantillas G que conducen a la incorporación de C,
pero cuando tratamos de copiar las plantillas
que contienen A y U, eso básicamente no funcionó en absoluto.
Así que asumimos que el problema era que el par de bases AU
es mucho más débil que el par de bases GC, lo cual es cierto.
Así que la solución fue simplemente volver
a la pizarra química
y mirar diferentes bases nitrogenadas que forman un par de bases parecido a AU,
pero que es tan fuerte como un par de bases GC.
Resulta, de hecho,
que esto ya se ha hecho en otros contextos.
Por lo tanto, gente como Chris Switzer, por ejemplo,
ha mirado el par de bases formado por D,
que es la abreviatura de diaminopurine, y propinilo-U,
que se ve por aquí.
Así que tenemos un grupo de propinilo en la posición 5' de la U,
y esto contribuye energía de apilamiento adicional.
El grupo de amino adicional en diaminopurine
nos devuelve el tercer enlace de hidrógeno,
y este par de base en el contexto de ADN
es esencialmente tan fuerte como un par de bases GC.
Por lo tanto, hicimos los monómeros activados correspondientes,
y efectivamente se resuelve el problema de la tasa.
Ahora podemos, utilizando este nucleótido activado de propinil -U,
podemos copiar una plantilla que consta de cuatro residuos de D,
y de hecho es muy rápido.
La reacción termina dentro de los primeros diez minutos.
Podemos copiar mediante el monómero activado de D,
una plantilla que consta de propinil-U;
es un poco más lento, pero aún así termina casi todo en menos de una hora .
¡No está mal!
Así que pensamos, bueno, tal vez realmente hemos resuelto el problema.
Seamos un poco más ambiciosos
y tratemos de copiar secuencias de plantilla cada vez más largas
que incluyen progresivamente más nucleótidos diferentes
en la secuencia.
Así que el primer paso se ve bastante bueno.
Aquí tenemos una plantilla que consta de tres D y tres C,
por lo que estamos incorporando tres propinil-U seguido de tres G,
y la reacción va bastante bien, dentro de unas pocas horas.
Si se omite el G, se pone lento donde debería ser;
si se omite el U, básicamente se pone lento casi desde el principio.
Así que se ve alentador.
Puedes ver algunos productos más cortos aquí,
lo cual nos hizo preocuparnos un poco por la
exactitud del proceso en general, pero no está mal.
A medida que avanzamos a las plantillas más largas, así que aquí una mezcla de G y C,
todavía podemos copiar todo el asunto, pero toma más tiempo,
y se ven más de estas secuencias intermedias
acumulándose. Esa realidad se vuelve mucho peor
cuando vamos a una secuencia aún más larga de 15 o 16 nucleótidos
que incorporan todas las cuatro bases en la plantilla.
Ahora todavía obtenemos un poco de producto de larga duración,
pero necesita mucho tiempo para acumularse,
y vemos una gran cantidad de estos productos intermedios estancados
acumulándose en el transcurso de la reacción.
Así que no lo sabemos a ciencia cierta,
pero sospechamos que estos intermediarios estancados
son el resultado de errores en el proceso de copiar la plantilla,
de manera que una cadena está creciendo, se forma una mala pareja
por una incorporación errónea
y eso ralentiza drásticamente la polimerización posterior.
Así que de hecho, creemos que
para obtener una copia más eficiente,
para acelerar la reacción global,
tenemos que resolver el problema de la fidelidad
y eso podría ayudar a resolver el problema de la tasa.
Entonces, ¿cómo podríamos hacerlo?
Bueno, podríamos ver diferentes bases nitrogenadas,
tal vez nuestra selección de D y propinilo-U no fue tan buena.
De hecho, hay razones químicas para pensar que eso es cierto.
En particular, el grupo de propinilo en U cambia el pKa de su N1,
lo que puede conducir a la formación de otros tautómeros
y malas parejas de bases.
Podríamos buscar otras redes troncales, lo cual ya estamos haciendo.
Así que existe la posibilidad de que, si la columna vertebral es
conformacionalmente restringida en la forma correcta,
eso favorecerá la incorporación de las bases adecuadas
y desfavorecerá la incorporación de bases erróneas.
También podríamos buscar sustratos de oligonucleótidos,
lo que en realidad resulta una muy buena idea.
Probablemente hay un montón de razones por las que esto sería útil.
Y también podríamos buscar la catálisis,
ya sea la catálisis mediada por ribozima
o tal vez la catálisis por pequeñas moléculas o péptidos cortos
que podrían haber estado ahí,
y ése es otro enfoque que estamos empezando a utilizar.
Volvamos a esta idea de mirar diferentes bases nitrogenadas.
Resulta que en realidad hay una sustitución muy simple
que se ve muy prometedor en esta etapa.
Aquí está el par de bases formado por D y propinil-U,
el cual creemos que está causando problemas con la fidelidad.
Una alternativa es reemplazar U con 2-thio-U,
es decir, U con un azufre en lugar del oxígeno
que normalmente está en la posición 2'.
Este es un análogo del U que en realidad se encuentra en la naturaleza,
en la biología moderna. Es un sustituyente común en los tRNAs,
donde desempeña el papel de estabilizar un par de bases AU
y aumentar la fidelidad de esa interacción.
La razón por la que funciona es porque
el azufre, que es más grande y polarizable,
contribuye a las interacciones de apilamiento.
El tamaño más grande se acomoda en un par de bases con A,
pero no se acomoda en un par de bases inseguro con U.
Así que parece tanto estabilizar el par de bases AU
como desfavorecer el apareamiento inseguro de bases incorrectas.
Por lo tanto, tenemos experimentos preliminares que sugieren que
éste es un enfoque prometedor, y seguimos observándolo.
Mientras tanto, también estamos mirando algunas de estas otras redes troncales,
así que aquí volvemos a la
versión de fosforamidato del ADN con enlaces 3'.
Aquí está el monómero correspondiente.
Nos gusta este sistema por razones distintas de las que tenemos para el sistema 2'.
Aquí estamos haciendo el enlace natural de 3'-5',
así que estamos un poco más cerca de hacer un producto parecido al ARN.
De hecho, los dúplex de esta versión 3' de fosforamidato
del ADN tienen una geometría muy parecida a la de ARN,
así que eso es agradable.
Estos monómeros pueden ciclarse,
por lo que este grupo de amino puede alcanzar el fósforo,
pero esa reacción es bastante lenta, así que no es un problema fatal.
Lo que puede, a la larga, ser un problema más grave
es que los dúplex tienen una temperatura de fusión muy alta.
Sin embargo, es un sistema interesante para estudiar
porque esta química parece suceder de manera muy eficaz, y de hecho,
vemos la incorporación eficiente de los cuatro nucleótidos naturales
mediante esta columna vertebral. Por lo tanto, muestra que
hay un acoplamiento muy importante entre la columna vertebral
química y las bases que están involucradas
en la formación de la estructura doble de Watson y Crick.
No entendemos por completo la naturaleza de ese acoplamiento.
Mencioné antes dos ácidos nucleicos
conformacionalmente restringidos y vinculados con dideshidrotimidina:
el ácido nucleico treosa (TNA) y la columna vertebral de morfolino,
que abreviamos como MoNa.
Estos son sistemas muy interesantes
y la esperanza es que la restricción conformacional
podría ser una manera de aumentar tanto la exactitud
como la tasa de la copia química.
Bueno, ¿por qué realmente pensamos eso?
Éste es un experimento que fue realizado por Jason Schrum
cuando él era un estudiante de posgrado en el laboratorio,
y estamos aquí mirando la incorporación de nucleósidos de amino 2' ,
extendiendo los primers donde la plantilla
se compone de una serie de polímeros diferentes.
Así que ADN aquí, una plantilla de ARN,
una plantilla de LNA (LNA significa ácido nucleico cerrado;
éste es un pariente de ARN, donde la conformación de azúcar está encerrada
en una conformación parecida a la del ARN mediante un enlace cruzado
debajo del azúcar).
Y aquí hay una plantilla de ADN con enlaces 2' -5'.
Así que lo que se ve en el transcurso de esta reacción de extensión del partidor
es que la reacción va bastante lentamente en una plantilla de ADN,
mucho más rápidamente en una plantilla de ARN,
pero incluso más rápidamente en la planilla conformacionalmente
restringida de LNA.
Así que éste fue nuestro primer indicio experimental verdadero
de que la restricción conformacional de una plantilla podría
realmente tener un efecto útil y significativo
en la velocidad de la polimerización.
Así que eso nos animó a seguir adelante y
hacer estas plantillas conformacionalmente restringidas,
a pesar de que la química sintética es un gran reto.
Aquí está la columna vertebral del ácido nucleico treosa,
así que de nuevo un azúcar de cuatro carbonos.
Aquí está el monómero correspondiente.
Se ha hecho cierto trabajo estructural en el Laboratorio Egli.
Uds. pueden ver que un dúplex de TNA parece, en un nivel bruto,
muy similar en su geometría general a un dúplex de ARN.
Así que esto, creo, es alentador por la posibilidad de que esta
columna vertebral restringida podría ayudar a posicionar
correctamente el nucleósido que entra, para acelerar
la polimerización y potencialmente hacer que sea más precisa.
Así que esperamos hacer esos experimentos
en los próximos años.
Esta es la columna vertebral de fosforamidato y morfolino,
de nuevo conformacionalmente restringida
de una manera muy diferente
porque el anillo de morfolino tiene seis miembros.
Estas moléculas son en realidad mucho más fáciles
de hacer que las moléculas de TNA.
Por eso, hemos podido empezar a ver la copia
de plantillas de morfolino por monómeros de morfolino,
así que pensamos que éste es otro sistema muy prometedor
para investigar experimentalmente los efectos
de la restricción conformacional en la tasa
y la fidelidad de la copia.
Así que, a pesar de que aún estamos lejos de tener
un sistema químico completo que pudiera conducir la replicación
de cualquier ácido nucleico o cualquier material genético,
podemos utilizar lo que hemos encontrado hasta el momento para aprender sobre
la compatibilidad de la química de la replicación genética
con nuestros sistemas de vesículas replicantes.
Por eso, podemos hacer experimentos donde encapsulamos
ácidos nucleicos dentro de vesículas y miramos la química de la copia.
Un ejemplo de eso se muestra aquí.
Este trabajo fue realizado por Sheref Mansy y Jason Schrum
y otras personas en mi laboratorio, hace unos años.
El experimento básico es tomar el mismo tipo
de complejo partidor-plantilla que ya han visto
y controlar la extensión del partidor por una
síntesis dirigida por plantillas.
Pero esta vez, el partidor-plantilla está dentro de
una de estas vesículas,
así que vamos a añadir el monómero activado al exterior.
Tiene que llegar al otro lado de la membrana de forma espontánea,
sin ningún tipo de maquinaria de transporte, para llegar al interior,
donde puede hacer esta química de copiar plantillas.
Así pues, aquí está el resultado experimental.
En este lado, se ve la reacción de control realizada en la solución,
se ve la acumulación de material de longitud completa durante 12-24 horas.
Aquí está el mismo experimento con un partidor-plantilla encapsulado
y se puede ver que la reacción se hace un poco más lenta
pero aún así a las 24 horas
se puede ver la acumulación de mayoritariamente un producto de longitud completa.
Así que fue realmente muy alentador para nosotros.
Este fue un avance verdaderamente importante porque indica que
sí, la química es compatible;
estos bloques de construcción pueden cruzar la membrana;
cuando llegan a la parte interior de la vesícula pueden copiar plantillas;
y una vez que hayamos desarrollado una química más general
para la copia de plantillas, deberíamos poder
combinarla con las vesículas replicantes
y obtener el sistema compuesto que ha sido nuestro objetivo desde el principio.
Ahora, en este experimento, la membrana se hizo
a partir de un sistema de laboratorio conveniente,
estos ácidos grasos insaturados de C14.
Podemos hacer los mismos experimentos con una mezcla mucho más
prebióticamente realista de ácidos grasos, alcoholes grasos,
sus ésteres de glicerol, cadenas saturadas de 10 carbonos,
y vemos lo mismo.
Esencialmente, durante 12-24 horas
los nucleótidos pueden cruzar estas membranas
y copiar plantillas. Por el contrario,
cuando la vesícula se hace a partir de moléculas más modernas
como los fosfolípidos, éstos son una barrera completa
a la penetración de estos nucleótidos,
así que no pasa nada. No se ve ninguna extensión del partidor.
Lo que nos dice esto es que,
para que esto funcione, para que este modelo protocelular funcione,
lla membrana necesita estar hecha de
las moléculas primitivas adecuadas,
es decir, ácidos grasos simples y moléculas relacionadas.
Y los nucleótidos tienen que ser
las moléculas primitivas adecuadas, no trifosfatos,
sino algo así como fosforimidazolides,
algo menos polar.
Bueno, así que con todo este trabajo,
¿estamos en realidad más cerca de volver a ARN
con nuevas ideas para la replicación completa?
Creo que lo estamos
y les voy a contar de uno de los avances conceptuales
que hemos hecho recientemente.
En realidad, esto viene de un experimento de selección
que fue realizado por Simon Trevino cuando era
estudiante de posgrado en el laboratorio.
El experimento abordó un tema de la homogeneidad de los monómeros:
¿qué tan importante es en un ambiente prebiótico
que los monómeros sean realmente puros y concentrados,
para que no hagamos redes troncales que tienen diferentes tipos
de enlaces, diferentes tipos de azúcares, etc.?
El experimento que podemos hacer en el laboratorio
es un poco más limitado,
pero lo que Simon elaboró fue una manera de tomar una
biblioteca de secuencias de ADN y transcribirla
en moléculas que no son sólo ARN,
sino una mezcla de ARN y ADN.
De hecho, en todas las posiciones en estas transcripciones
hay más o menos una posibilidad de 50-50 de que la vinculación
sea un ribonucleótido o un desoxirribonucleótido.
Así que tenemos una heterogeneidad troncal extrema,
ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos,
y esa variación no es heredable.
El experimento consistía en tomar esta biblioteca
y luego seleccionar las moléculas funcionales.
Seleccionamos aptámeros simplemente mediante la unión a una molécula de objetivo.
Los objetivos que se utilizaron fueron ATP y GTP,
porque habíamos hecho esto muchas veces.
Es fácil evolucionar moléculas de ARN o moléculas de ADN
que reconocen específicamente estos nucleótidos,
pero en este experimento, la muestra no es ARN o ADN puros,
es este esqueleto polimérico mixto.
Entonces, lo que Simon encontró fue que podía eludir
los ciclos de selección y amplificación.
Cada vez que hacemos la amplificación,
reintroducimos esta heterogeneidad de la columna vertebral,
pero por supuesto, las moléculas quedan mezcladas.
El orden exacto de vínculos entre los ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos es aleatorio
en cada ronda del proceso de selección.
Sin embargo, después de unas cuantas rondas de selección,
Simon pudo obtener aptámeros
que se unieron a su objetivo con gran especificidad.
No eran tan buenos en términos de afinidad
como los aptámeros que obtenemos de ARN o ADN puros,
pero todavía funcionan.
Así que esto nos indicó que a lo mejor la heterogeneidad de los monómeros
no era tan importante como habíamos pensado.
Tal vez en realidad se podría desarrollar moléculas funcionales,
ribozimas, a pesar de la heterogeneidad no hereditaria
de la columna vertebral.
¿Por qué es tan importante en el contexto del ARN?
Bueno, uno de los grandes problemas con el ARN es la especificidad de región,
el hecho de que en un sistema químico,
parece casi inevitable que se forme alguna fracción de
enlaces 2'-5'.
Creo que el experimento de Simon sugiere que esto
todavía puede permitir la evolución de las ribozimas,
así que esto es algo que necesita ser investigado experimentalmente,
lo cual estamos haciendo ahora.
Ahora, si eso resulta ser cierto,
y todavía se puede obtener moléculas funcionales a pesar de
esta heterogeneidad de la columna vertebral,
entonces la implicación importante proviene del hecho de que
ya sabemos que los enlaces 2'-5' de la columna vertebral
bajan drásticamente la temperatura de fusión de un dúplex de ARN.
Como resultado, ahora sería posible
separar los filamentos térmicamente después de la copia
de una plantilla de ARN.
Por lo tanto, es posible que esta heterogeneidad de 2' versus 3',
que considerábamos un problema tan grande en el ARN,
sea en realidad lo que permitió a ARN servir
como el material genético primordial,
porque permite la separación térmica de las cadenas,
y por ende permite los ciclos repetidos del
copiado de la plantilla y la separación de hebras que
nos dan la réplica global.
Así que éste es el tipo de cosas que estamos estudiando activamente.
Algunas otras ideas acerca de escenarios más
primitivos para la copia de la plantilla...
Todo el trabajo que hemos hecho,
y que muchas otras personas han hecho a lo largo de las décadas,
ha tendido a centrarse en la reacción de la extensión del partidor
con monómeros, porque éste es un enfoque muy simple
y ***íticamente manejable para el problema
de la copia de la plantilla. Se recibe un montón de información,
es fácil analizar los productos mediante métodos sencillos
como la electroforesis en gel,
pero es probable que sea completamente irreal
como un escenario prebiótico.
Así que esto nos lleva a pensar en el copiado de plantillas
mediante mezclas de oligómeros cortos, de secuencia aleatoria,
junto a monómeros, dímeros, etc.
Es una situación mucho más desordenada.
Tenemos muchos tipos diferentes de sustratos,
el número de los productos parciales de la copia de plantilla
se vuelve enorme, por lo que el problema ***ítico
se hace mucho peor. Pero hoy en día,
contamos con las técnicas ***íticas más avanzadas.
Y con métodos avanzados de espectrometría de masas,
esperamos poder analizar estos
tipos de reacciones, y tal vez veremos que
este tipo de sistema proporciona beneficios inesperados.
Tenemos la posibilidad de nuclear la química del copiado
de múltiples sitios. La incorporación de oligómeros
significa que se necesitan menos pasos catalíticos o químicos.
Así que estamos muy entusiasmados por seguir este tipo de
escenario desordenado, pero más natural,
con la esperanza de que esto nos aceque
a un escenario realista para la replicación completa.
Así que quiero terminar simplemente señalando que
en este escenario mucho más desordenado,
hay formas completamente nuevas para pensar
en cómo las ribozimas, los ARN catalíticos, contribuyen
al proceso general de la replicación.
Hasta ahora, hemos pensado exclusivamente en la replicación del ARN
catalizada por ARN, que ocurre a través de catalizadores de ARN
que son polimerasas de ARN.
Pero en estos casos,
creo que en realidad es posible
que la replicasa primordial haya sido una nucleasa.
Por ejemplo, si un oligómero se une y luego se extiende,
pero se comete un error, entonces se hace una mala pareja.
Como hemos dicho, eso ralentiza
la extensión posterior del partidor,
así que puede ser un efecto drástico.
Por lo tanto, si hubiera una nucleasa de ribozima
que pudiera recortar ese error,
permitiría que la copia química volviera a la normalidad.
Así que sería una manera de acelerar el procedimiento.
Otro escenario viene de pensar
en el uso de los sustratos de oligonucleótidos.
Podría ser que los oligonucleótidos superpuestos
se unan a una plantilla. Esta
sería una situación sin salida,
a menos que tengamos una nucleasa que pueda venir,
recortar la superposición y permitir que la ligadura química
termine el proceso de la copia de la plantilla.
Por lo tanto, creo que estos cambios en la forma
de la que pensamos el proceso han realmente
abierto una gran cantidad de experimentos nuevos.
Y me han hecho muy optimista sobre la posibilidad
de conseguir un sistema de replicación completa,
ya sea sólo químicamente o por una combinación de
reacciones químicas y otras catalizadas por ARN.
Para resumir entonces,
creo que estas consideraciones nos dicen que
la pureza de los monómeros no es tan importante.
Es posible que cierta heterogeneidad en la columna vertebral
no sea fatal.
La especificidad de región incompleta puede estar bien;
los enlaces 2' pueden resolver el problema de la fusión de ARN.
Y estamos muy entusiasmados con estudiar 2-thio-U
como una simple sustitución de nucleótidos que es prebióticamente plausible,
algo que podría mejorar tanto la tasa como la fidelidad.
Así que al poner todas estas cosas juntas,
tenemos la esperanza de que en los próximos años
lleguemos a un acuerdo sobre un sistema químico completo
para la replicación del ARN o tal vez algún polímero relacionado.
Y si podemos llegar a ese punto,
combinarlo con el sistema de replicación vesicular
debe permitirnos observar la aparición espontánea
de los procesos darwinianos desde un sistema puramente químico.
Ese es realmente el objetivo principal de todo esto,
y es la parte del proyecto más relevante
para la aparición de la biología a partir de la
química de la Tierra primitiva.
Así que, de nuevo, he tratado de mencionar a la gente a lo largo de la charla.
En términos de la química,
muchas personas han contribuido a ésta en el transcurso de los años:
Jason Schrum, Ricardo Alonso, Matt Powner, Na Zhang,
Ben Heuberger, Craig Blain y Shenglong Zhang.
Muchas personas han contribuido a este trabajo,
por lo que han jugado un papel muy importante en el desarrollo
de todas estas nuevas ideas que nos están llevando, ojalá
hacia una solución a este problema importante
de pensar sobre el origen de la vida.
Gracias.