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Hola y bienvenidos a los seminarios iBio. Mi nombre es Dianne Newman y soy profesora
del Instituto de Tecnología de California en las divisiones de Biología, Ciencias Geológicas y Planetarias.
También soy investigadora del Instituto Médico Howard Hughes.
En esta segunda parte de mi conferencia voy a dar un ejemplo de cómo funciona la diversidad microbiana en
entornos de todo el mundo actual, donde vamos a hablar de
cómo las bacterias pueden respirar un compuesto tóxico llamado arseniato, arsénico V,
y cómo esta capacidad puede afectar la geoquímica de su entorno de una manera muy significativa.
Estamos motivados para estudiar la respiración microbiana del arsénico porque el arsénico es tóxico,
y las actividades de los microorganismos son muy relevantes para liberar arsénico
en los suministros de agua, lo que puede conducir a cánceres de piel, tales como él que se muestra aquí
en las manos de una mujer de Bangladesh.
Ahora estas lesiones que se ven son procedentes de queratosis de la piel,
pero a un nivel más molecular sabemos que el arsénico es extremadamente dañino para las células
independientemente del estado de oxidación en el que existe.
El arsénico puede existir como arseniato, arsénico V, y en esta forma es muy similar al fosfato.
Por eso, las células se confunden y ocupan arseniato
cuando quieren ocupar fosfato, y en vez de añadir fosfato inorgánico al ADP para generar energía,
a veces añaden arseniato.
Esto es inestable y se hidrolizarápidamente y conduce a una interrupción en la generación de energía.
Ahora, el arsénico también puede existir en otra forma común en el entorno y dentro de las células vivas,
como arsenito, arsénico III. Esta forma es aún más perjudicial para las células
que arseniato porque como es la forma más reducida, arsenito
puede reaccionar con los grupos de azufre reducidos se encuentran en proteínas muy fácilmente.
Cuando hace esto, se une a estas proteínas, las distorsiona
y desnaturaliza y causa que ya no tengan su función normal.
Ahora, en los EE.UU. tenemos reglas estrictas sobre los estándares de agua potable
en términos de la concentración máxima de arsénico en el agua potable.
Que yo sepa es alrededor de 10 microgramos por litro, aunque ese número puede ser más pequeño ahora.
Pero en otras partes del mundo, por ejemplo en Bangladesh,
donde hay realmente un nivel trágicamente alto de arsénico en las fuentes de agua potable,
las concentraciones pueden llegar hasta los 1.000 microgramos por litro.
Lo que quiero mostrar aquí es que tanto en los EE.UU. como en Bangladesh hay concentraciones
significativamente elevadas en diversas partes de los dos países.
En los EE.UU. ... lo que están viendo es un gráfico que fue producido por el USGS hace varios años,
y está graficando regiones donde las concentraciones de arsénico llegan a ser muy altas.
En áreas rojas y naranjas tenemos concentraciones superiores a los niveles
que están aprobados para el suministro de agua potable.
Me voy a centrar más adelante en la charla en una parte de este mapa, en el norte de California,
donde las concentraciones de arsénico son muy grandes, y voy a describir la relevancia
que tienen los microorganismos en términos de afectar la geoquímica de arsénico en estos ambientes.
Muy bien, así que ahora estamos viendo un plano de Bangladesh,
donde las concentraciones de arsénico en el agua potable son
muy altas, muy elevadas, y de hecho en muchos lugares
están muy por encima de lo que se considera el nivel de seguridad mediante normas de la EPA en los EE.UU.
Un ejemplo dramático de esto se revela simplemente cuando miramos aquí.
En las regiones moradas, la probabilidad de que la concentración de arsénico en el agua potable
sea mayor que 50 microgramos por litro es de más de 70%.
Es por lo menos 70% en estas regiones, y ésta es una zona significativa del país. Entonces,
¿cómo llega el arsénico al agua potable en estos ambientes y cuál es la relación con la actividad microbiana?
La conexión es impulsada por el metabolismo microbiano y los metabolismos específicamente anaeróbicos
que se producen en los sedimentos una vez que el oxígeno se agota en estos entornos.
Lo que muestro aquí es una visión muy simplificada del ciclo geoquímico del arsénico en un ambiente
de agua dulce. Lo que quiero abordar es esta parte de la diapositiva aquí
donde se ve la caja que está representando la transformación entre arseniato, arsénico V y arsenito.
Estas son las dos formas principales de arsénico inorgánico.
Otras partes de este esquema que no voy a describir
ahora representan otras vías que están implicadas en la metilación de las especies de arsénico.
Este es un tema interesante en sí mismo, pero vamos a limitar nuestra atención aquí
a este ciclo inorgánico porque es probable que sea la parte más importante en el control de la geoquímica
de arsénico en los suministros de agua potable en muchos entornos, como en Bangladesh.
Lo que sabemos es que en estos entornos
arsénico V puede ser atrapado muchas veces en asociación con los minerales de hierro
donde desciende a los sedimentos.
Se queda allí ligado a estas especies de hidróxidos-óxidos férricos, donde está coprecipitando
o es adsorbido por estos minerales de hierro.
A este arseniato, debido a su carga aniónica, le gusta unirse bien a estos minerales con carga positiva.
Por lo tanto, permanece asociado con ellos.
Se mantendría feliz en los sedimentos si no fuera por la deposición
de un donador de electrones, una fuente de carbono orgánico, a menudo alimentada por letrinas,
por ejemplo en Bangladesh, que proporciona un sustrato fértil para promover el crecimiento microbiano.
En estos sedimentos, por supuesto, hay otros aceptores de electrones que se pueden utilizar para la
respiración y éstos incluyen oxígeno, como un ejemplo primario, nitrato a veces, a veces otros sustratos,
pero muchas veces estos otros aceptores de electrones que tienen un potencial redox superior se agotan.
Una vez que esto sucede, hay todavía una gran cantidad de carbono orgánico que necesita ser oxidado
y que se quema por el uso de arsénico y hierro en estos sedimentos como aceptores de electrones para
la respiración microbiana. Cuando las bacterias empiezan a respiran arsénico, lo reducen de arsénico V
al arsénico III, así que arseniato se vuelve arsenito.
Arsenito no está cargado al pH de las aguas naturales
y como tal no adsorbe bien bajo la mayoría de las condiciones, aunque todavía puede adsorber.
Sería demasiado simplista decir que se vuelve totalmente soluble,
pero en general creo que es justo decir que cuando las bacterias reducen arseniato a arsenito,
esto afecta su movilidad, lo que permite al arsenito entrar en el suministro de agua, dejar los sedimentos,
y ser llevadas allí en sistemas de aguas subterráneas hacia el agua potable.
Así que al descubrir que microorganismos que respiran arsénico están catalizando este paso crucial,
nos interesó poder predecir su actividad.
Sin embargo, hace muchos años, bueno, no es que hace muchos años, hace 10 años
esto era muy difícil de hacer porque no se sabía nada acerca
del mecanismo molecular en que se basaba la respiración microbiana de arsénico.
Todo lo que se sabía era que había diversos organismos del árbol de la vida.
Así que si se acuerdan de mi primera conferencia del gran árbol filogenético que les mostré,
aquí hay una versión reducida, donde la mayoría de estos organismos
pertenecen a la familia de bacterias, aunque hay algunos aquí en la arquea,
pero todos estos organismos interactúan en cierto modo con arsénico.
Sin embargo, hace diez años atrás no sabíamos, como ya dije, cómo lo hacen.
¿Cuál fué la biología molecular que subyace a la manera en que pueden utilizar arsénico en la respiración?
Así que mi grupo se dispuso a responder a esta pregunta. Lo que necesitábamos en el momento
era una cepa que podríamos utilizar como un sistema modelo
con el fin de profundizar en este proceso.
Fuimos a un entorno donde pensábamos que podríamos aislar un organismo que respira arseniato
y que sería fácil de examinar en el laboratorio.
Fácil de examinar significa que podríamos cultivarlo allí, bajo atmósferas normales,
sin tener que preocuparnos de mantenerlo estrictamente anaeróbico todo el tiempo,
lo cual, hasta el aislamiento de este organismo, ha sido el caso de las bacterias que respiran arsenato, descritas anteriormente,
estos organismos que sólo podían crecer en condiciones anaeróbicas.
Ahora, esta bacteria proviene de un muelle en Woods Hole.
Esto es Woods Hole, Massachusetts. Allí está el Laboratorio de Biología Marina. Una estudiante en el curso
de verano de la diversidad microbiana, para su proyecto independiente me ayudó a aislar un organismo desde
chips de madera de este muelle. Fuimos a este muelle de madera porque el arsénico se utilizaba
como conservante de madera. Por eso razonamos que si pudiéramos encontrar bacterias en esta madera,
probablemente serían organismos capaces de resistir el arsénico, porque esta madera estaba llena de él,
y también capaces de tolerar la exposición a la atmósfera, ya que íbamos a recogerlos
justo en la interfase aire/agua donde verían una gran cantidad de oxígeno
o al menos así pensábamosmos o esperábamos.
Nuestro primer enriquecimiento fue uno donde los pusimos en condiciones anaeróbicas en una botella,
les dimos una fuente de alimento y arseniato como único receptor de electrones para la respiración.
Preguntamos si podían crecer y reducir el arsénico.
La forma de averiguar si estaban reduciendo el arsénico era si el frasco se ponía amarillo.
Esta es una prueba muy simple. Es una prueba para la producción de trisulfuro de arsénico, As2S3,
que es la fórmula molecular para el trisulfuro de arsénico.
Es un mineral de color amarillo que se produce sólo cuando arseniato se reduce a arsenito,
y luego se combina con sulfuro de arsenito para generar este mineral amarillo
bajo las condiciones de pH relevantes para la botella.
Así que viendo esto pudimos entonces desentrañar el organismo que catalizaba esta reacción,
e hicimos un aislamiento muy específico donde exigimos que
este organismo también pudiera crecer en un medio rico en una placa de laboratorio.
Al ir y venir entre la botella anaeróbica y la placa rica, hemos podido
en última instancia aislar una bacteria, que se muestra aquí,
que llamamos Shewanella sp. cepa ANA-3. La razón por la que la nombramos Shewanella
es porque cuando secuenciamos su ADN ribosomal, en particular la subunidad 16S,
que como mencioné antes se utiliza a menudo, se utiliza muchas, muchas veces en la filogenia microbiana
para comprender la relación evolutiva de un organismo con otros.
Quedó muy claro que esta cepa que se aisló está agrupada en un género más amplio llamado Shewanella.
ANA-3 fue un hallazgo fantástico para nosotros porque, como les dije, exigimos que pudiera crecer fácilmente
en placas, y esto abrió la posibilidad de realizar experimentos
donde pudimos hacer manipulaciones genéticas y seleccionar colonias individuales
en estas placas, como las colonias que se ven aquí que tienen una mutación específica.
Antes de entrar en la posibilidad de hacer mutagénesis
y la manipulación genética de estos organismos,
sin embargo, queríamos verificar que este organismo realmente podría respirar arseniato.
La forma más rigurosa de hacerlo, más allá de ver si la botella se vuelve amarilla,
es medir el acoplamiento de la reducción de arseniato a arsenito
a la oxidación de lactato a acetato.
Ahora sólo voy a mostrar los datos de la reducción de arseniato,
pero Uds. pueden confiar en que los datos también indican
una relación estequiométrica muy simpática entre las cantidades molares de lactato oxidándose al acetato
y cómo arseniato es reducido a arsenito,
en una proporción de uno a dos, como se predijo a partir de esta fórmula metabólica.
Lo que se ve es que empezando al tiempo cero dimos a estos organismos diez concentraciones milimolares
de arseniato, que ellos luego redujeron y concomitantemente convirtieron en arsenito
y al mismo tiempo crecieron por muchas generaciones porque ésta es ahora una representación logarítmica.
Esto fue lo que se esperaría de un organismo que puede respirar el arseniato.
Así que nos quedamos muy contentos porque en esta botella el único aceptador de electrones para el crecimiento era arseniato.
Avanzando hacia el futuro, lo que queríamos hacer era identificar el sistema enzimático que cataliza
la conversión de arseniato a arsenito.
Les dije en mi conferencia introductoria que una manera en que los organismos generan ATP
es acoplar la transferencia de electrones de un donante de electrones,
en este caso lactato, que está siendo oxidado a acetato,
a través de la membrana. Esta contiene una cadena respiratoria de proteínas y pequeñas moléculas
que no sólo pueden pasar electrones por la membrana, sino también y concomitantemente
trasladar los protones de la membrana, generando este gradiente que se puede utilizar para producir ATP.
Ahora, al final de esta cadena se encuentra lo que era nuestro objetivo,
la enzima responsable de finalmente recibir estos electrones de la cadena
y pasarlos a arseniato, reduciéndolo a arsenito.
Esto era desconocido cuando empezamos.
Sin embargo, antes de nosotros, investigadores examinaron diferentes organismos
y establecieron que había un sistema de desintoxicación separado
en muchos organismos que les permite resistir el arsénico,
y esto funciona como se resume y se muestra aquí, donde en estos
regímenes de desintoxicación...cuando estas bacterias veían
arsénico V, y eso entraba en la célula por algún sistema de transporte de fosfato,
lo reducían a arsenito por una proteína llamada ArsC,
y entonces este arsenito de alguna manera era reconocido por una bomba de eflujo
compuesta de varias proteínas ArsA y B que expulsaban arsenito del interior de la célula.
Ahora, esto era bien conocido por eso pudimos usar
sistemas donde la gente había tomado previamente cepas que solían ser resistentes al arsénico.
Eliminamos genéticamente los genes necesarios para conferir esa resistencia,
y entonces pudimos proporcionar genes de nuestro organismo,
Shewanella ANA-3, y preguntamos si podíamos restaurar la capacidad de estos organismos de
resistir el arsénico o incluso respirarlo, si podíamos conferir esa capacidad a estos organismos.
Este enfoque se centró en la obtención de una función. Tomamos el ADN de Shewanella ANA-3
y lo cortamos en trozos que pudimos clonar en un vector.
Entonces colocamos cada uno de estos vectores en distintas
células de nuestra cepa huésped que por sí sola era incapaz, en este caso, de simplemente resistir
el arsénico en altas concentraciones. Al examinar una variedad de estas cepas,
encontramos un clon que confiere resistencia al arsénico en E. coli
como se puede ver aquí. Lo que ven ahora es la densidad óptica de los cultivos de una noche de E. coli
que no contienen en este caso ningún plásmido, y eso se muestra aquí con los triángulos.
A medida que la concentración de arsenito se eleva a más de 0,1 milimolares,
se ve que rápidamente dejan de poder crecer en absoluto.
Mientras que con un plásmido especial que encontramos con genes de Shewanella ANA-3,
pudieron resistir y crecer muy bien, incluso en concentraciones hasta los 10 milimolares.
Aquí tenemos un control del vector sin el ADN de nuestra ANA-3.
Ahora ¿son necesarios también estos genes para la capacidad de respirar arseniato?
Identificamos por este enfoque de obtención de función
el sistema de Ars que tiene Shewanella ANA-3, ya que puede complementar el mutante eliminado en su propio
sistema de estos genes Ars. Como les dije, ArsA y ArsB y ArsC
son necesarios para la vía de desintoxicación.
Así que para saber si esta vía de desintoxicación era necesaria para la respiración de ANA-3...
queríamos responder a esta pregunta porque queríamos ver si había otra vía por ahí que podría
ser importante para la respiración de arseniato y que sería completamente independiente de esa vía.
Generamos una inserción de transposón en ArsB que codifica la proteína implicada en el eflujo de arsenito
de la célula y esto tuvo el efecto simultáneo de eliminar la expresión del gen "downstream", ArsC.
Este codifica la reductasa de arseniato, que como dije está dentro de la célula
y que fue demostrada como necesaria para la reducción de arseniato relacionada con la desintoxicación.
Así que cuando lo hicimos, ahora todo esta manipulación genética se hizo en Shewanella ANA-3.
Encontramos que la respuesta es no, que este mutante que no tiene un ArsB o ArsC funcional,
era todavía capaz de respirar arsénico. Aquí en rojo se puede ver su crecimiento
en densidad óptica a lo largo de varios días.
Sin embargo, mientras el arseniato se reduce en la cepa salvaje, el cultivo crece bastante bien.
Pero en este mutante que hicimos y que pudo crecer todavía y aquí en rojo
mientras que podía reducir el arseniato, se detuvo, se estancó y nunca pudo crecer a la misma
densidad que las células de tipo salvaje. Lo que esto nos indicó es que aunque claramente hay
otro sistema enzimático necesario para la respiración
de arseniato, estos genes implicados en la desintoxicación son importantes todavía.
Eso es intuitivo. A medida que el organismo produce más y más arseniato,
a medida que el arsenito se acumula en la célula,
el organismo necesita un mecanismo para deshacerse de él, y esta vía de la desintoxicación de arsénico
se hace en relevante.
Si la reducción es necesaria o no es otro tema, pero la maquinaria para sacar el producto, arsenito,
definitivamente tiene cierta relevancia en altas concentraciones.
Así que ahora empezó la cacería de los genes que codifican la reductasa de arseniato respiratoria,
después de constatar que hay una actividad enzimática independiente de la reductasa de arsenato
de desintoxicación. Y aquí tuvimos mucha suerte.
En este primer plásmido que clonamos, lo que encontramos, como ya les dije, fueron todos estos genes
que codifican el sistema necesario para la desintoxicación,
el sistema de Ars. Pero justo al lado había un par de genes
y afortunadamente recogimos sólo el comienzo de uno de estos genes en nuestro clon inicial.
Estábamos motivados para seguir secuenciando porque cuando secuenciamos esta parte de nuestro clon aquí,
observamos que el extremo amino tenía cierta homología con las enzimas de la familia de proteínas
reductasa de dimetilsulfóxido. Esta es una familia de proteínas que se encarga de
diferentes tipos de respiración microbiana anaeróbica, enzimas que sirven como terminal de aceptores de electrones
para sustratos distintos del oxígeno, incluyendo dimetilsulfóxido, DMSO.
Así que al secuenciar más, encontramos estos dos genes "downstream"
en rojo, que hemos llamado la arrA y arrB.
Supusimos que como estos genes estaban justo al lado de los genes ArsA, B y C,
podrían codificar los genes para la reductasa de arseniato respiratoria.
Este fue uno de esos momentos en la ciencia
cuando simplemente tienes mucha suerte, y resultó así.
Aquí está la prueba. La manera de demostrar esto es eliminar esos genes y luego hacer
el mismo experimento que mencioné antes, donde dimos a las células sólo arsénico como receptor
de electrones y preguntamos si podrían reducirlo y crecer.
Aquí los datos que estoy mostrando son los datos de la reducción de arseniato,
donde el tipo salvaje en rojo es capaz de reducir el arseniato
muy rápidamente, mientras que si eliminamos el gen arrA o arrB
no hay reducción. Lo que no estoy mostrando es que no hubo crecimiento aquí en estos cultivos tampoco.
Luego, cuando los complementamos, cuando les devolvimos la versión salvaje de estos genes,
pudimos recuperar el crecimiento y restaurar la actividad de reducción de arseniato.
Así que después de encontrar éstos, lo que esto nos sugiere es que
la vía podría ser diagramada como se muestra aquí en términos de transporte de electrones.
Como he mencionado antes, el proceso de la fosforilación oxidativa
depende de la transferencia de electrones desde un donante de electrones a un aceptor de electrones.
En este caso, es el arseniato, que entra en la célula y se reduce a arsenito.
Y el acoplamiento de la transferencia de electrones de donantes como el lactato que se oxida a acetato
a través de complejos de enzimas y moléculas pequeñas como quinonas
o menaquinonas, finalmente a estas enzimas sl extremo de la cola que son los aceptadores de los electrones.
A medida que se pasan estos electrones, los protones son translocados,
y esto genera esa batería que, como expliqué en mi primer discurso, se forma en torno a esta membrana
y que luego se puede utilizar a través de la ATP sintasa para impulsar la formación de ATP y la fosforilación oxidativa.
Ahora, lo que les dije al principio fue que la proteína ArsC, que es la
enzima implicada en la reducción del arsénico
para la desintoxicación, está al interior de la célula.
Lo que supusimos al observar los datos de la secuencia
de nuestras proteínas arrA y arrB fue que tenían motivos que sugerían que probablemente
se ubican aquí en este compartimento, que se llama el periplasma.
Ese es el espacio entre la membrana externa y la membrana citoplasmática
en las bacterias gram negativas. Ahora, sabiendo que el arseniato podría ser bombeado a la célula
a través de la membrana externa...o por porinas, transportadores, por lo que no necesariamente se bombea,
sino que simplemente es ingresado por estas grandes porinas. Los transportadores que lo bombean
se encuentran aquí en esta membrana interna. Supusimos que esta enzima, si se encuentra aquí en el
periplasma, sería identificable si pudiéramos ponerle una etiqueta fluorescente como un anillo alrededor
de la célula. Así que si la enzima se encontrara en la célula, si se hiciera una vista microscópica de la célula,
todo realmente se vería verde,
mientras que si esa proteína estuviera sólo dentro de este compartimento externo, se visualizaría como
un anillo. Eso es lo que hicimos. Y aquí se ven, como predijimos, anillos formándose.
Verificamos esto a través de técnicas bioquímicas más clásicas y fraccionamiento
para demostrar que esta actividad es de hecho periplásmica.
Ahora ¿por qué importa todo esto?
Bueno, en este punto, hemos identificado una nueva enzima.
Sabemos algo acerca de dónde se encuentra, pero en realidad la motivación de este proyecto se inició con
tratar de entender un problema ambiental y cómo desarrollar un marcador para
la actividad de estos organismos en el medio ambiente.
Los ambientes de los que estamos hablando son sedimentos como los que se muestran aquí,
los cuales, como dije, existen en Bangladesh y en muchas otras partes del mundo,
donde el arsénico es absorbido en gran abundancia en minerales de hierro
que recogen en estos sedimentos. Ahora, al principio les dije que lo que se sabía sobre los organismos que
respiran arsénico cuando comenzamos este proyecto era que eran filogenéticamente diversos.
Aquí hay una pequeña imagen que ilustra este concepto
y los nombres no son importantes. Solo presten atención a los puntos aquí.
Lo importante es que los puntos están por todas partes en este árbol,
y éstos son organismos que en sí son metabólicamente versátiles.
Así que al sólo buscar una firma, una firma genética de una especie en particular,
uno nunca podrá predecir si se produce la respiración de arsenato o no
porque estas especies pueden respirar otros metabolitos. Así que no sabríamos necesariamente
si respiran arsénico in situ. Por otra parte,
los familiares cercanos de las especies que pueden respirar arsénico a veces no lo pueden hacer,
por lo que la indicación de las especies no es lo suficientemente buena para el seguimiento de esta actividad.
Donde tuvimos mucha suerte fue que en nuestro modelo del sistema de Shewanella ANA-3,
el gen y la proteína codificada por ese gen, los cuales, como descubrimos,
catalizan el paso clave en la conversión de arseniato a arsenito, a saber, la proteína arrA junto a la arrB
fueron notablemente bien conservadas sobre este mismo grupo de organismos evolutivamente diverso.
A medida que continuamos investigando la enzimología de esta familia de reductasas respiratorias de arseniato,
encontramos que forman este grupo estrecho.
Debido a esto, razonamos que podríamos ir tras este grupo utilizando sondas que son
específicas para detectar la expresión del gen que codifica esta enzima en el medio ambiente.
Para hacer esto, miramos el gen arrA y lo dividimos en secciones aquí.
Buscamos en estas secciones a los que pertenecieran
a la familia de enzimas de las reductasas de arseniato y que no fueran similares en estas regiones particulares
a otras enzimas de esta familia más amplia de reductasa DMSO porque
que no queríamos un marcador que mostrara la familia entera.
Queríamos un marcador que pudiera identificar específicamente
esta rama de la familia, la rama de reductasa de arsenato.
Así que miramos estos dos dominios que aquí llamamos E y F,
y diseñamos partidores de PCR que pueden sacar un fragmento muy breve
en una reacción de PCR que podríamos secuenciar. Esperábamos que este tramo en particular fuera amplificado
sólo en células que contienen la enzima arrA en lugar del gen,
y a continuación, que el gen codificara la enzima que cataliza la reacción. Lo que
estamos viendo son los controles de bacterias que tienen las proteínas de la familia de reductasa DMSO.
Es todo este grupo aquí en azul, pero no contienen el gen arrA.
Entonces los números 5-19, en lugar de 6-19,
contienen o pertenecen a organismos que respiran arsenato.
Tomamos el ADN de todas estas diferentes bacterias e hicimos un control para asegurarnos de que
podíamos amplificar sólo al buscar el producto de los partidores para enfocar el gen 16S del ADN ribosomal.
Felizmente en nuestros controles negativos no pudimos detectar un producto,
pero en todas salvo estas dos últimas filas aquí,
aunque sea muy tenue, créanme que
vimos la amplificación del producto que estábamos buscando.
Para la gran mayoría de estas bacterias, el número 19 es en realidad una archea por lo que no estábamos
tan preocupados por esto porque inferiríamos potencialmente que las reductasas de arseniato
podrían haber evolucionado a lo largo de una vía ligeramente diferente en las archeas
en relación a las bacterias. No obstante, parece que tenemos una secuencia corta bastante robusta
que podríamos usar para hacer un seguimiento de la presencia de este gen o su expresión.
Así que con esta herramienta en la mano, queríamos ir a un ambiente y preguntar
si este gen es importante en el control de la geoquímica en ese sitio.
Lo primero que tuvimos que establecer era si
se requiere este gen y la enzima que codifica para que arseniato sea convertido en los sedimentos ricos en hierro.
Por ejemplo en este sitio aquí donde hay arsénico absorbido en minerales férricos de oxihidróxido,
¿veríamos la reducción de arseniato a arsenito en estos entornos
en ausencia de arrA? Si la respuesta fuera negativa, entonces si pudiéramos detectar
la presencia de la proteína arrA, o en este caso su expresión,
el ARN mensajero del gen que codifica esa proteína,
entonces podríamos tener una muy buena razón para asociar los perfiles geoquímicos de los sedimentos
que mostraron reducción con un proceso microbiológicamente catalizado
e impulsado por esta enzima. Entonces, con esto como el primer paso lógico e importante,
podríamos ir a ver si esos genes estaban realmente presentes
y se expresaban en los sedimentos de interés.
Por lo tanto, la forma en que llegamos a esto es que primero pudimos sintetizar en el laboratorio
sedimentos que imitaban los del entorno natural que acabo de mostrar.
No voy a mostrar todos nuestros controles, sino un solo archivo de datos representativos aquí.
Pero lo que encontramos fue muy emocionante, y era,
como esperábamos, la transformación de arsénico. Ahora estamos viendo arseniatos que de nuevo
desaparecen y son transformados en arsenito. Eso sólo se produjo cuando había actividad de arrA,
y eso nos fue revelado en estos experimentos al examinar la proporción de ARN y ADN para la secuencia arrA,
y al ver un pico de expresión justo cuando la reducción de arseniato a arsenito estaba en su máximo.
En los controles donde añadimos organismos que genéticamente habíamos eliminado por su capacidad de
expresar esta proteína, no vimos ninguna reducción de arseniato en estas condiciones.
Así que en la ausencia de algún reductor químico, fue absolutamente necesario un proceso biológicamente catalizado
para las transformaciones de arseniato en estas condiciones muy ambientalmente relevantes.
Así que ahora vamos a ir a un entorno real
y ver cómo funciona este sistema.
Bueno. Así que decidimos ir al embalse Haiwee, que está al norte de la ciudad de Los Angeles,
y se encuentra en la parte sureste del estado de California.
Los Angeles está justo por aquí y San Francisco allí.
Y el Lago Mono que está aquí cerca de la frontera con Nevada,
el cual, como les dije en mi conferencia introductoria, tiene concentraciones muy altas de arsénico,
alimenta esto mediante el acueducto de California. Este acueducto lleva cargas muy altas de arsénico.
Así que estas concentraciones están muy por encima de lo necesario para satisfacer las normas de la EPA
para las concentraciones en el suministro de agua potable, que, les recuerdo, son de 10 microgramos por litro.
Algo tiene que suceder y una de las formas en que el arsénico se reduce
en su concentración en el agua es por reacción con cloruro férrico,
que se añade al agua mientras baja por el acueducto
en la Planta de Tratamiento de Cottonwood que está varios kilómetros aguas arriba del embalse de Haiwee.
Ahora, en la Planta de Tratamiento de Cottonwood el cloruro de hierro se inyecta en el agua.
Cuando llega al agua, debido a que el pH es más o menos neutral, el hierro III en este cloruro de hierro
se convierte rápidamente en óxido, minerales amorfos de hierro de oxihidróxido férrico, y como he dicho,
a arseniato le gusta absorber y adherirse a estos minerales muy bien.
Así el arsénico queda ligado y co-precipitado con estos óxidos de hierro
y juntos llegan por el acueducto de Los Ángeles y
terminan sedimentándose en este canal aquí, que lleva al embalse de Haiwee, y ésta es una vista de la canal.
Ahora, fue este ambiente en particular adonde fueron los estudiantes de mi laboratorio y el de
un antiguo colega mío en Caltech, la profesora Janet Hering.
Y aquí hay dos estudiantes, aunque ahora hacen otras cosas.
Son postdoctorantes en diferentes lugares. Mi estudiante Davin Malasarn y una estudiante de Janet, Kate
Campbell, ambos de los cuales están ocultos en esta foto, pero entraron en el canal de sedimentos de Haiwee
y tomaron estos núcleos. Kate era geoquímica y ella y otros en el laboratorio de Janet Hering estaban estudiando
estos sedimentos durante años y estaban muy familiarizados con la mineralogía y la geoquímica acuosa
dentro de estos sedimentos. Han realizado estudios extensos. Así que Kate y Davin se unieron,
y lo que Davin había hecho era desarrollar, en colaboración con Chad Saltikov en mi laboratorio,
esta sonda para buscar la reductasa respiratoria de arsenato dentro de los sedimentos reales.
Así que la primera cosa que queríamos entender es si el perfil geoquímico
dentro de este núcleo podría indicar que se estaban produciendo actividades microbianas.
Como les dije, en este tipo de ambientes sedimentarios,
si vemos arseniato transformándose en arsenito,
ése es un indicio muy, muy poderoso de que la actividad microbiana debe estar presente
porque en ausencia de cualquier otro tipo de reductor químico que en estos sedimentos en particular no está presente,
arseniato de otro modo sería estable.
Lo que Janet y unos antiguos alumnos pudieron demostrar por
técnicas espectroscópicas de rayos X muy sofisticadas que ahora voy a explicar muy simplemente
es que a medida que avanzas por estas columnas que acabo de mostrar, la especiación de arsénico cambia.
Eso se puede ver aquí. Estos son perfiles espectrales de una curva que se obtienen mediante un tipo
elegante de espectroscopia de rayos X, llamada XANES, por arsenito, arsénico III y arseniato.
Ahora lo que ven son los perfiles de diferentes profundidades en centímetros al bajar a ese núcleo.
En las capas muy superiores, en los primeros dos y tanto centímetros
de los sedimentos, la mayor parte del arsénico se está alineando con la joroba del arsénico V. Muy rápido,
cuando se avanza a menos de dos centímetros y medio, se ve que el pico cambia y ahora está alineado con el
arsenito, arsénico III. Esto era convincente evidencia geoquímica de que se estaba produciendo algún tipo de
proceso microbiano. Por lo tanto, la guinda de la torta para juntarlo todo
sería demostrar que en estos sedimentos
este gen, arrA, no sólo estuviera presente, sino que también se expresara en ARN mensajero,
que luego, por supuesto, se convirtiera en la proteína que cataliza la transformación de arseniato a arsenito.
Así que la principal contribución de Davin, junto a Kate y sus colegas,
fue entrar en estos núcleos, extraer el ADN y el ARN,
secuenciarlo, y lo más impresionante que encontró
fue que 62-97% de las secuencias que encontró
eran idénticas a las de organismos que se sabe que respiran arsenato.
Aquí hemos demostrado efectivamente que el ARN mensajero de este gen arrA, que era nuestro indicador robusto
de la capacidad de los organismos para respirar arseniato, no sólo estaba presente,
sino también expresado en los sedimentos de Haiwee. Puesto que sabíamos que en estos sedimentos
la expresión de este gen se requiere para la transformación de arseniato a arsenito
pudimos con mucha firmeza concluir que
la actividad microbiana y la actividad respiratoria microbiana estaba catalizando este proceso.
Para resumir, lo que espero haberles enseñado en esta conferencia
es que muchos microorganismos respiran arsenato,
y ahora muchos más son conocidos, más allá de lo que mostré anteriormente en la charla.
La lista crece más y más cada año.
Pero, sorprendentemente, la evolución ha conservado el mecanismo,
por lo que la gran mayoría de estos organismos son capaces de catalizar la actividad.
Debido a esto, podemos mirar un gen específico,
el gen arrA, como un marcador para este proceso.
Podemos generar sondas para detectar este gen en una variedad de entornos, y estas sondas han sido
optimizadas más recientemente por Chad Saltikov, quien es un ex-investigador postdoctoral de mi laboratorio,
pero ahora es profesor de la Universidad de California en Santa Cruz y ha podido tomar nuestro trabajo inicial
con estos cebadores y extenderlo mucho más lejos en una variedad de entornos. Ahora ésta es realmente
una forma establecida de rastrear la actividad de los organismos que respiran arsenato en el medio ambiente,
y esperamos que esto sea útil en países de todo el mundo
donde el arsénico es un problema, donde sería relevante entender
si las actividades microbianas se están produciendo porque eso podría afectar las estrategias de remediación
para limitar la conversión de arseniato a arsenito en esos entornos.
Me gustaría reconocer a los que ayudaron en esto, como he hecho en toda la charla, y ahora mostrando
sus imágenes. Por supuesto, todos estos tipos de proyectos
se llevan a cabo por estudiantes muy talentosos y postdoctorados
en el laboratorio. Tuve mucha suerte al trabajar con dos grandes tipos:
Chad Saltikov, quien fue uno de los primeros investigadores postdoctorales en mi laboratorio y ahora es
profesor en la Universidad de California en Santa Cruz, en el departamento de toxicología ambiental,
y Davin Malasarn, un estudiante de posgrado en biología en Caltech, que ahora es un postdoctorado en UCLA.
Junto a nuestros colegas y colaboradores del Caltech, Janet Hering y su estudiante Kate Campbell,
y un colega en el Reino Unido, Joanne Santini, pudimos hacer los descubrimientos que he resumido en este breve charla.
Todo nuestro trabajo ha sido apoyado por una variedad de agencias, y me gustaría reconocerlas aquí.
Para este proyecto en particular, la Fundación Luce y la Fundación Packard fueron
muy importantes al principio, y más tarde fue el HHMI, y Chad fue apoyado por su beca independiente
de la NSF.
Gracias y éste es el final de la segunda serie del seminario iBio sobre la diversidad microbiana.