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Hola, mi nombre es Richard Losick y soy profesor de la Universidad de Harvard.
El título de mi ponencia es "La biología del desarrollo de un organismo simple".
Por lo general, pensamos en el desarrollo biológico en el marco de los organismos multicelulares complejos.
Sin embargo, incluso las formas más primitivas de las células también pueden presentar procesos dramáticos
en la diferenciación celular y la morfogénesis. Voy a darles un ejemplo
con una bacteria que forma esporas, Bacillus subtilis.
Permítanme presentarles a Bacillus subtilis de la forma en que se introdujo
a la comunidad académica en 1877 por su descubridor Ferdinand Cohn.
Ferdinand Cohn publicó sus descubrimientos en la biología de las plantas y dibujó lo que vio
en esta placa maravillosa que Uds. ven aquí. Lo que es evidente en la placa
es que vio largas cadenas de células que tenían pequeños cuerpos ovoides adentro,
que reconoció como esporas bacterianas. Así que éste fue el descubrimiento
de la formación de esporas por bacterias.
Uds. también deben saber que esta bacteria benigna, Bacillus subtilis, tiene un primo malo.
Es el ántrax patógeno, Bacillus anthracis, que fue descubierto
por Robert Koch en aproximadamente la misma época en que Cohn hizo su descubrimiento. Cohn y Koch
decidieron publicar juntos sus hallazgos en la biología de las plantas y de hecho, este dibujo
contiene contribuciones de Koch para Bacillus anthracis
así como de Cohn para Bacillus subtilis.
He dividido mi exposición en tres partes. La primera parte se refiere al proceso,
el proceso general por el que B. subtilis tiene una espora.
La segunda parte es una nueva investigación sobre la multicelularidad. Tradicionalmente hemos considerado
Bacillus subtilis y muchas otras bacterias como criaturas solitarias
que se dedican a sus actividades como células individuales, pero ahora hemos llegado a apreciar que
Bacillus subtilis hace elaborados comunidades multicelulares y que
la formación de esporas se lleva a cabo en estas comunidades.
La última parte es el tema de la aleatoriedad y el destino celular.
Se cree generalmente que las decisiones de destino celular
en la biología del desarrollo están altamente determinadas.
Y de hecho lo son. Pero hemos empezado a ver ejemplos donde
las decisiones sobre el destino celular se realizan de una manera estocástica,
y ése será el tema de mi última presentación,
que tendrá cuatro ejemplos de Bacillus subtilis.
Bueno, para empezar esta parte de mi charla:
Bacillus subtilis hace una espora. ¿Cómo la hace?
Hay tres temas principales: la primera es que la formación de esporas implica dos células.
Esto es realmente una historia de dos células. Van a ver que dos células colaboran en crear una sola espora.
Después de haber creado dos células, cada célula tiene su propio destino,
sigue su propio programa distinto para la expresión génica,
y esto se rige por una serie de factores de transcripción que actúan de una manera específica a la célula.
La última parte de mi charla concierne cómo las dos células se comunican entre sí.
Las dos células no son completamente independientes, aunque sigan
sus propios programas de expresión génica, sino que hablan
en cada etapa del desarrollo para mantener los dos procesos en coordinación entre sí.
Aquí, en forma de dibujos, están las etapas principales de la formación de esporas.
La formación de esporas es desencadenada por la limitación de nutrientes, y el resultado es que las células entran en una vía
que implica la formación de dos células diferentes. En el comienzo tenemos una sola célula,
y me referiré a esto como el esporangio pre-divisional.
Luego, ese esporangio pre-divisional se somete al
proceso conspicuamente asimétrico de la división celular, en la que un septo de división es
formado cerca de un polo extremo de la célula. Eso divide la célula en desarrollo
en dos células: una célula preespora, la célula más pequeña, y una célula madre más grande.
El preespora está destinada a convertirse en la espora,
mientras que la célula madre nutre el desarrollo de esporas
y finalmente libera la espora madura. En esta etapa temprana de desarrollo,
la preespora y la célula madre se encuentran una al lado de otra. Pero más tarde en el desarrollo,
en un proceso biológico notable, la célula madre se traga la preespora,
en un proceso que se asemeja a la fagocitosis en células superiores,
rodeando totalmente la preespora y soltándola
como célula libre en el citoplasma de la célula madre para crear una célula dentro de una célula.
Así que esa célula interna se convertirá en la espora y la célula madre externa nutre la espora y
entonces eventualmente libera la espora por lisis.
Aquí hay micrografías de fluorescencia de células en las distintas etapas de la esporulación.
Las células se han teñido con un tinte de membrana
para resaltar las características de las que he estado hablando.
En la etapa de división asimétrica, se puede ver que un septo polar se forma
en una posición extrema polar en el esporangio. A continuación, la membrana de la célula madre
comienza a migrar en torno a la preespora, eventualmente la envuelve completamente,
y luego la suelta como una célula libre en el esporangio.
Entonces, ¿cómo sucede este proceso de división asimétrica?
Pues bien, las bacterias se dividen por medio de una proteína tubulina, llamado FtsZ,
que forma un anillo citokinético conocido como el anillo Z.
Las células superiores dependen de la actina, las bacterias se basan en la tubulina.
Aquí hay una micrografía de fluorescencia que muestra el anillo Z,
que ha sido etiquetado con la proteína de fluorescencia verde.
Está al centro de las células y en el sitio futuro de la división celular en una célula que crece vegetativamente.
Así pues, cuando las células crecen, se forma un anillo Z en el centro
y se convierte luego en un septo de división
para dar lugar a dos células hijas iguales de tamaño. Sin embargo, cuando las células entran en la vía para esporular,
lo que sucede es que se forman dos anillos Z, uno cerca de cada polo del esporangio.
Entonces sólo uno de estos dos anillos Z se convierte en un septo de división
mientras que el otro es desmontado.
De modo que al final del proceso, tenemos un solo septo polar
que ha creado las dos células desiguales de tamaño.
Ahora bien, esto plantea inmediatamente cuestiones interesantes acerca de cómo
cada una de estas dos células adquiere un cromosoma.
El esporangio pre-divisional tiene dos cromosomas y el reto para el desarrollo de la célula
es asegurar que la preespora y la célula madre hereden un cromosoma completo.
Cuando se esporula, B. subtilis se somete este proceso de una manera fascinante
que se diferencia de casi todos los tipos de células que conocemos.
Aquí hay una caricatura que ilustra cómo son los cromosomas en una célula que está creciendo.
Están en dos masas conocidas como nucleoides,
y cada cromosoma, por supuesto, tiene un origen de replicación
y los orígenes se encuentran en los bordes exteriores de las dos masas de ADN.
Cuando las células entran en la vía para esporular, estas dos masas de ADN se convierten en
un filamento, conocido como el filamento axial, que se extiende a través de la célula
de polo a polo con cada uno de los dos orígenes en los polos extremos opuestos del esporangio.
Se puede ver esto en esta micrografía de fluorescencia, en la que el ADN en esta diapositiva
está marcado en verde y el contorno de la célula en rojo.
En la célula que crece, se puede ver dos masas distintas de ADN
y en la célula que ha empezado a esporular se puede ver que el ADN es
alargado y se extiende a través de la célula.
La caricatura interpretativa muestra que los orígenes se encuentran en
los polos extremos de este filamento axial.
¿Cómo sucede esto? Pues bien, este proceso de la remodelación del cromosoma en un filamento y
su anclaje en los polos está mediada por dos proteínas.
Se llaman RacA y DivIVA. RacA se une al ADN en múltiples sitios para colapsarlo,
pero sobre todo en torno al origen para crear una especie de velcro que se pega
a DivIVA, una proteína que está anclada en los polos de la célula.
Así se puede ver eso en esta caricatura. DivIVA en los polos opuestos de la célula.
Aquí están las dos masas de ADN.
Cuando aparece RacA, se une en diversos sitios alrededor de los dos cromosomas
para ayudar a colapsarlo, pero forma una estructura con muchas moléculas de RacA
en las regiones de origen. Como se muestra en esta ilustración, los cromosomas se extienden
y se adhieren a los polos. Déjenme enseñárselo una vez más. Aquí está la proteína RacA,
y aquí está el proceso mediante el cual es atraída a los polos opuestos del esporangio.
Ahora, por fin, la división asimétrica se lleva a cabo.
Pero pueden apreciar de inmediato que cuando el septo de división desciende,
debido a su colocación polar extrema,
sólo algunos de los cromosomas destinados a la preespora
estarán en la célula pequeña. Así que Uds. pueden ver esto en estas micrografías de fluorescencia.
Justo después de que se forma el septo de división, sólo un poco de ADN se encuentra en la preespora,
que fue atrapado por estar anclado en el polo. Pero en el transcurso del tiempo,
el resto del cromosoma es bombeado al compartimento de preespora
hasta que un cromosoma completo esté presente en la preespora. Este bombeo
de un cromosoma a la preespora está mediado por una máquina molecular,
una proteína llamada la translocasa de ADN,
que se encuentra en el septo y utiliza la energía del ATP
para bombear la porción restante del cromosoma al compartimento de preespora.
Por eso, la mayoría de las células, o casi todas las células que conocemos, separan sus cromosomas antes
de la citocinesis. Pero en la esporulación de las células, la citocinesis ocurre antes de la segregación de cromosomas.
Podemos visualizar la translocasa de ADN que media esta segregación cromosómica al
etiquetarla con la proteína de fluorescencia verde que se muestra en este dibujo.
Así que aquí hay un esporangio y se puede ver el septo polar
y este enfoque positivo de fluorescencia verde
de la translocasa de ADN, que está sentada entre
la célula madre y la preespora y está preparada para bombear ADN
a través del septo en la cámara pequeña
del esporangio. Así que para revisar todo lo que he dicho hasta ahora,
en la primera etapa de división asimétrica, la proteína Z es remodelada para formar anillos
en cada polo del esporangio. Entonces, uno de estos dos anillos de Z se convierte en un septo de división
y el otro anillo Z es desmontado.
A continuación, los cromosomas deben ser separados en las dos células.
Mientras que los anillos Z se están formando, los dos cromosomas son remodelados
en un filamento axial por la proteína RacA, lo cual causa que se colapsen
en filamento alargado y ancla los orígenes en los polos,
donde la proteína DivIVA está presente.
Entonces ocurre la división asimétrica y la translocasa de ADN situada en el septo de división
bombea el resto del cromosoma de la preespora a la cámara pequeña del esporangio.
Así que cuando este proceso termina, tenemos dos células que están al lado;
cada una tiene un cromosoma completo. En la siguiente etapa de desarrollo,
la membrana de la célula madre migra en la preespora
para engullirla completamente y soltarla como una célula libre dentro de otra célula. Ahora el proceso de esporulación
está en marcha y esa célula interior madurará en una espora. Esta conversión de esa célula interior
en una espora consiste en tres principios, tres procesos morfogenéticos.
El primero es la remodelación del cromosoma de la preespora en una estructura semejante a un doughnut,
en el que el estado es altamente resistente a la radiación. El segundo es la formación de una gruesa
capa de material de la pared celular, llamado corteza, alrededor de la preespora.
Luego una espesa cubierta de proteína formada por
muchas proteínas diferentes crea un escudo protector
alrededor de la espora. El siguiente dibujo ilustra estos procesos.
Uds. verán el cromosoma de la preespora siendo remodelado
en un doughnut. La zona blanca es la corteza,
y la gruesa cubierta de proteínas se crea en la parte exterior.
Esto entonces se madura en una espora parecida a una pelota de golf. La célula madre, después de haber hecho su trabajo,
lisa y libera la espora madura, que puede permanecer inerte
durante muchos años, pero en un momento dado, cuando
vuelven las buenas condiciones, puede abrirse como un huevo y dar lugar a una célula
que puede reanudar el crecimiento vegetativo y la fisión binaria.
Bueno, hemos visto ahora cómo se forman dos células durante la esporulación.
El punto clave es que cada una de estas células tiene que seguir su propio programa
de expresión génica. Estas dos células tienen sus propios caminos de diferenciación celular,
la preespora y la célula madre.
Estas vías de diferenciación son impulsadas por factores de transcripción
que actúan de un modo específico a la célula y ése es el tema del que quiero hablar ahora.
Por lo tanto, en este dibujo he indicado los cinco principales
factores de transcripción que dirigen el proceso de esporulación.
El primero se conoce como Spo0A y es el regulador maestro de la esporulación.
Es la proteína que se activa en respuesta a la limitación de nutrientes
y causa que la célula entre en esta vía y causa que sucedan todos los eventos
que he estado describiendo, incluyendo la división asimétrica.
Después de que la división asimétrica se lleva a cabo,
aparece un factor de transcripción que se llama sigmaF.
SigmaF es miembro de una familia de proteínas reguladoras
que existen en las bacterias, conocidas como los factores sigma de la ARN polimerasa. Su función es
unirse a la ARN polimerasa y dirigirla a ciertos tipos de promotores...
secuencias de promotores en el cromosoma.
El primero de estos factores sigma, sigmaF, se activa en el compartimento de preespora.
Entonces, un factor sigma llamado sigmaE se activa en el compartimiento de células madre.
Después de la engullición, sigmaF es reemplazado en la preespora
por un factor de transcripción llamado sigmaG.
Por último, en la célula madre, aparece el factor de transcripción final
en el programa de desarrollo, sigmaK.
El hecho de que estos factores de transcripción actúen de una manera específica a las células
puede verse en el recuadro a la derecha.
Aquí les muestro esporangios que albergan el gen de la
proteína de fluorescencia verde unido a un promotor bajo el control de sigmaE,
en el ejemplo de arriba, o un promotor controlado por sigmaG en el ejemplo de abajo.
Se puede ver en el caso de arriba que la fluorescencia está restringida a la célula madre,
el compartimento en el que sigmaE está activo.
Considerando eso en el ejemplo de abajo, tenemos el patrón opuesto.
La fluorescencia se acumula en el compartimento de preespora
donde sigmaG está activo.
Así cada uno de estos cuatro factores sigma actúan de una manera específica a la célula.
Cada uno ha presentado un enigma en cuanto a los mecanismos moleculares
que hacen que se activen en un tipo celular específico.
A lo largo de los años, hemos ayudado a desentrañar estos misterios
y averiguar cómo estos cuatro factores de transcripción son activados.
Déjenme contarles una historia sobre lo que sabemos acerca de la activación de sigmaF.
SigmaF, como hemos visto, se activa en la preespora
pero en realidad es sintetizado y presente en el esporangio pre-divisional.
No está activo en el esporangio pre-divisional porque lo mantiene inactivo
una proteína antagonista llamada AB.
AB es lo que se llama un factor anti-sigma, que se une a sigmaF y lo mantiene en un estado inerte.
AB mantiene a sigmaF inerte en la célula pre-divisional y también
después de la división asimétrica de la célula madre.
Pero en la preespora, sigmaF logra escapar de AB y
se activa al dirigir la expresión génica.
¿Cómo escapa?
Su escape está mediado por otra proteína que llamamos AA.
AA es un factor anti-anti-sigma que reacciona con un complejo de AB y sigmaF
para soltar un sigmaF libre y activo.
AA en sí está regulada por la fosforilación. Es un fosfato de proteínas y
en su estado fosforilado está inactiva y en su estado no fosforilado
está activa y capaz de desencadenar la activación de sigmaF.
Esta conversión de la forma fosfo a la forma defosfo está mediada por
una fosfatasa llamada E. Entonces E convierte el fosfato-AA a AA.
Luego AA reacciona con sigmaF-AB para soltar
un sigmaF libre y activo en el compartimiento de preespora.
¿Cómo sucede esto en la preespora?
Bueno, no tenemos una respuesta completa a esta pregunta.
Pero sin duda, una pista importante es el descubrimiento de que la fosfatasa E
está situada en el septo que divide las dos células.
Así que aquí hemos marcado la fosfatasa E con la proteína de fluorescencia verde.
Eso se puede ver en el panel izquierdo de fluorescencia.
En el panel derecho de fluorescencia, hemos manchado las membranas de los esporangios
con un colorante rojo de membrana. Se puede ver que la proteína E se encuentra en el septo.
De alguna manera, actúa preferentemente o exclusivamente en el lado preesporal del septo
para causar que sigmaF se active en ese compartimiento y no el compartimiento de las células madre.
Así que déjenme resumir todo lo que he dicho hasta ahora:
AA, AB, la activación de sigmaF, utilizando un campo de células
donde cada célula alberga el gen
para la proteína de fluorescencia verde en fusión con un promotor
bajo el control de sigmaF.
Al comienzo de esta película se puede ver que todas las células son de color oscuro;
no tienen fluorescencia. A continuación tiene lugar la división asimétrica.
Luego sigmaF se activa y se ven los focos de color verde brillante que aparecen
masivamente en las células de este campo a medida que comienzan a esporular.
Entonces esos focos verdes brillantes se convierten en cuerpos brillantes de la fase opaca
cuando la esporulación ha terminado. Veamos esto una última vez.
Este es el campo de las células y la fluorescencia verde aparece masivamente
cerca de un extremo de cada uno de los esporangios.
Luego los focos verdes se convierten cuerpos brillantes de fase que representan las esporas maduras.
Bueno, vamos ahora al último tema.
Quizás los he dejado con la impresión de que después de la división asimétrica
la preespora y la célula madre marchan a su propio ritmo,
que siguen independientemente sus propios programas de expresión génica.
Pero nada podría estar más lejos de la verdad
porque las dos células conversan
en cada etapa del desarrollo. Se hablan
entre sí a fin de coordinar el progreso del desarrollo en una célula
para el progreso del desarrollo de la otra célula.
Así que, para empezar, como hemos visto, sigmaF se activa en el compartimiento de preespora.
Pero sigmaE no aparece hasta que sigmaF esté activo.
SigmaF envía una señal a través de las membranas que separan las dos células
que conduce a la activación de sigmaE en la célula madre.
Una vez que sigmaE se activa en la célula madre, él a su vez envía otra señal
que conduce a la activación de sigmaG en la célula de preespora,
el ya engullido compartimiento de preespora.
Una vez que sigmaG se activa, él a su vez envía una señal a la célula madre
que permite que aparezca el factor de transcripción final en esta secuencia, sigmaK.
Así que las dos células se están hablando una a otra
en una conversación de dos vías: de preespora a célula madre,
de célula madre a preespora, a preespora a célula madre.
Vamos a escuchar una de estas conversaciones
para ver el lenguaje entre las dos células,
en la última conversación, en la que sigmaG indica a la célula madre que active a sigmaK.
Esto funciona de la siguiente manera:
sigmaK se sintetiza inicialmente como una pro-proteína inactiva.
Es decir, el producto primario del gen tiene una extensión N-terminal
de aproximadamente 20 aminoácidos, que hace inactivo a pro-sigmaK.
Para activarse, una proteasa necesita cortar esa extensión N-terminal
para generar la forma madura y activa del factor de transcripción.
Se puede ver eso en este experimento de Western blot.
Este es un experimento en el que todas las proteínas de la célula en esporulación fueron
separadas en un gel y luego sigmaK y pro-sigmaK fueron visualizados
con anticuerpos contra la proteína. Como se puede ver, en una célula esporulante de tipo salvaje
la mayor parte del sigmaK está en la forma de la proteína madura y activa
y hay relativamente poco sigmaK en la forma más grande de la pro-proteína.
Esta conversión de la forma pro a la forma madura depende de la acción de sigmaG.
Uds. pueden ver este punto clave si utilizamos un mutante de sigmaG.
Cuando sigmaG es mutante, no hay conversión, y si nos fijamos en el análisis de Western blot
en el extremo derecho del mutante, ahora se puede ver que todas las proteínas
están en la forma pro y pocas o ningunas están en la forma madura del factor sigma.
De alguna manera, la activación de sigmaK en una célula depende de los eventos genéticos
que tienen lugar en la célula adyacente. ¿Cómo funciona esto?
Bueno, la proteasa es una proteína de membrana y media la escisión de la pro-secuencia.
Sin embargo, inicialmente se mantiene inactiva por dos proteínas de membrana
que son inhibidores y juntas mantienen a la proteína en un complejo inactivo.
Para que la proteasa se active,
tiene que escapar de esta inhibición.
Ese evento es causado por una proteína de señalización
que es producida en el compartimento de preespora bajo el control de sigmaG.
Así que sigmaG activa el gen para una proteína de señalización,
esa proteína es secretada a través de la membrana
de la preespora, donde interactúa con un complejo de proteínas
que incluye la proteasa y sus proteínas inhibidoras,
e invierte la inhibición de modo que ahora pueda ocurrir
la escisión de pro-sigmaK a la forma madura del factor de transcripción.
Esta proteasa resulta especialmente interesante por dos motivos.
En primer lugar, se deduce que su sitio activo se encuentra en la membrana.
Las barras azules representan las regiones catalíticas inferidas
de la proteasa y se infiere que la extensión N-terminal en sigmaK
se inserta en una cavidad, en la membrana, creada por la proteasa.
Pues bien, este tipo de membrana que conduce a la escisión del gen...a la activación de la expresión génica,
es un precursor de algo que está muy extendido en la biología
y se conoce como la proteolisis intermembrana regulada.
Curiosamente, este mismo ejemplo de ello en una bacteria
se conserva hasta los mamíferos.
Los mamíferos tienen una proteasa con características homólogas a las de la proteasa bacteriana,
en particular el centro catalítico. En el caso de los mamíferos,
la proteasa activa un factor de transcripción que está unido a la membrana
y la escisión por la proteasa lo libera de la membrana,
por lo que puede migrar al núcleo y activar la expresión génica,
en este caso, los genes implicados en el metabolismo del colesterol.
Pero el principio general es el mismo.
Dos factores de transcripción están en estados inactivos y requieren la proteólisis para ser activados
de modo que puedan activar los genes.
Y las proteasas similares, conservadas durante eones de evolución, median ambos procesos.
Finalmente, voy a apuntarlos a Uds. en la dirección de las futuras investigaciones,
lo que yo veo como un reto principal para el futuro.
Hemos hablado de la biología celular de la esporulación y hemos hablado de
la expresión orquestada de genes bajo el control
de una serie de factores de transcripción específicos a la célula.
Estos factores de transcripción están activando más de 500 genes
de una manera temporal y específica. Y son los productos de los genes
los que median la morfogénesis que culmina en la espora.
Así que el reto final es entender cómo las múltiples proteínas
producidas bajo el control de sigmaF, E, G y K median la morfogénesis, dirigen
el montaje de la espora hacia esta notable estructura latente que puede resistir
de manera robusta los estragos del tiempo y los insultos del medio ambiente.
Gracias.