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Hola. Mi nombre es Tony Hyman. Soy el director del Instituto Max Planck en Dresden, Alemania.
En el fondo, se ve una película de un embrión de C. elegans
entrando en mitosis.
Y una de las cosas que llama la atención, por supuesto, cuando uno mira una película como ésta,
es que el propio huso tiene dos polos.
Hay un polo aquí en rojo, y hay otro allí.
Eso, por supuesto, está en el centro de toda división celular,
porque los cromosomas, cuando lo deciden, van a estos polos diferentes.
Hay que tener dos polos para que los cromosomas se segreguen en dos masas.
Por lo tanto, se puede preguntar, ¿por qué hay dos polos?
Esta es una pregunta que ha interesado a los biólogos por más de 100 años.
Esta es una foto de la obra de Bovary, el gran citólogo alemán del siglo XIX.
Esto viene de un libro de E.B. Wilson llamado "La célula en el desarrollo y la herencia",
donde se resume mucho de este conocimiento
que fue descubierto a fines del siglo XIX y comienzos del XX.
Bovary también estaba fascinado por este problema,
donde se podía ver que el eje siempre tiene dos polos,
y ¿cómo se establece esta la bipolaridad?
Lo que me gustaría hablar con Uds. en este segmento de la charla
es la construcción de un complejo de proteínas muy complejo
llamado un centríolo.
Aquí, se puede ver que los centríolos son bastante grandes en nuestra escala.
Aquí tenemos nuestras moléculas de tubulina, cuando estábamos haciendo los microtúbulos.
Los centríolos son de otra magnitud, y por lo tanto son complejos
en términos de su organización.
Al menos en algunos sistemas
la forma en que los centríolos se duplican es lo que define el hecho
de que haya dos polos en un huso mitótico.
Bovary estaba también interesado en este problema
cuando tiñó unos husos mitóticos con colorantes diferentes
No tenía acceso a la fluorescencia en aquellos días,
pero de todas formas pudo ver un montón de subestructura.
Se puede ver específicamente en esta foto, tomada en realidad por Joe Gall:
es una de las imágenes microscópicas originales de Bovary.
El pudo ver esta pequeña estructura en el centro del centrosoma,
que ahora sabemos que probablemente es el centríolo.
El centríolo está en el medio del centrosoma.
El centrosoma, conocido como el material pericentriolar,
rodea este centríolo, que tiende a existir como un par de centríolos vinculados,
que tienden a ser ortogonales entre sí.
Una de las preguntas que siempre ha sido interesante en este campo es
cómo crecen los centríolos?
Es fascinante que una vez por ciclo celular
cada centríolo haga un centríolo hijo, duplicado.
Al igual que el ADN, también se hace una copia de cada hebra de ADN.
Lo mismo es cierto para los centríolos, y eso ha interesado mucho a la gente
a lo largo de los años.
El trabajo de tres personas resolvió este problema
en los mbriones de C. elegans, a un nivel morfológico:
Thomas Mueller-Reichert y O'Toole Eileen, dos microscopistas electrónicos,
y Laurence Pelletier, quien era biólogo celular.
Decidieron atacar este problema en embriones de C. elegans.
Ahora, el problema con estudiar los centríolos es que
su abundancia es extremadamente baja--sólo hay 2 por célula.
Si usted toma los ribosomas, hay muchos, 1.000 de ribosomas por célula.
La bioquímica es extremadamente difícil.
Y también cambian a través del ciclo celular.
Así que la mayoría de los complejos estudiados hasta ahora
por su estructura, normalmente han sido aislados bioquímicamente --proteasomas o ribosomas.
Así que, ¿cómo vamos a estudiar este problema de crecimiento centríolo?
Bueno, en primer lugar vamos a hacer una pregunta simple.
Lo que he hecho aquí, y lo verán a través de esta charla,
es que he esbozado la línea de tiempo de la biología celular de C. elegans en este eje.
Uds. pueden ver los diferentes eventos aquí, y el tiempo en este eje fundamental aquí.
Así que durante este proceso, podemos preguntar, ¿cuándo se duplican los centríolos?
Ahora, los centríolos son pequeños, y no podemos verlos en el microscopio óptico.
Ciertamente, no podemos ver...bueno, podemos ver centríolos individuales,
pero no se puede ver fácilmente si hay 1 o 2.
Así que para hacer esto, realmente hay que utilizar el microscopio electrónico.
Entonces queremos preguntar,
¿cuándo en realidad se duplican los centríolos durante este tiempo?
Para hacer eso, hay que decir, bueno, estoy aquí
en este momento del punto X. Lo que quiero hacer es ver los centríolos por microscopía electrónica
y eso es lo que conocemos como la microscopía de luz y la microscopía electrónica correlativa.
Usamos la microscopía de luz en un organismo vivo
para obtener el tiempo del sistema,
y luego tenemos que utilizar la microscopía electrónica
para ver ese sistema y preguntar qué apariencia tienen los centríolos mismos.
Una manera de hacerlo es mediante el uso de la fijación.
Sin embargo, tenemos que poder fijarlo en puntos de tiempo determinados.
Y podemos hacerlo por un pequeño truco en C. elegans,
que es que los embriones tienen una cáscara de huevo.
Ahora bien, esta cáscara de huevo ha ido evolucionando hermosamente durante millones de años
para excluir todo. Estos embriones existen en la tierra,
por lo que sabemos, y tienen que ser capaces de resistir las agresiones externas.
Pero, en realidad puedes penetrar la cáscara del huevo con un láser.
Se puede tomar un rayo láser, en un experimento muy de la era espacial,
y dirigirlo a la cáscara del huevo y hacer un pequeño agujero.
Así que Uds. pueden hacer este experimento entretenido
donde se puede rodear el embrión con glutaraldehído,
que es un fijador, y no penetra la cáscara del huevo
porque es una estructura increíble.
A continuación, aparecerá un agujero en la cáscara de huevo, el glutaraldehído entra
y fija los embriones. Vamos a verlo en esta película.
Lo que van a ver es el embrión moviéndose un poco --
ahí es donde se abre con un láser,
y lo verán fijándose. Entonces, aquí va.
¡Pop! Se ve que es fijo.
¡Y pop! El otro está fijado.
¿Se dieron cuenta de como, cuando lo fijamos,
todo el movimiento se detuvo? Es un proceso muy rápido, la fijación.
El glutaraldehído es una molécula muy pequeña, entra, lo fija y entonces se puede procesor los embriones
para microscopía electrónica
mediante cortes en serie.
Lo que ese experimento demostró es que
los centríolos no están duplicados por aquí.
Y si se mira pocos minutos después, ahora se han duplicado.
Así que por la metafase se han realmente duplicado.
Es un proceso muy rápido, los centríolos han pasado de no duplicados a duplicados.
Por eso se puede concluir que hay un proceso de duplicación que ocurre
temprano en el ciclo celular de C. elegans.
Pero entonces se puede hacer la pregunta
de ¿cómo se duplican?
La técnica que utilizábamos entonces - la fijación con glutaraldehído -
no era lo suficientemente buena para decirnos cómo el centríolo mismo es creado.
Pudimos ver centríolos no duplicados y pudimos ver estos centríolos bien formados,
pero no pudimos ver las diferentes etapas de duplicación del centríolo.
¿Cómo se forman?
Son estructuras muy complejas, y ésa es la pregunta que queríamos hacer.
Ahora, con el fin de hacer eso, nos tuvimos que cambiar a otro tipo de técnica,
que se conoce como tomografía de electrones.
Para hacer la tomografía, teníamos que ser capaces de regresar y detener a los embriones,
pero teníamos que ser capaces de detenerlos por congelación.
Así que una manera en que preservemos las estructuras en la biología
sin perturbar su ultraestructura es por congelación...la congelación muy rápida
preserva los componentes biológicos sin molestarlos tanto en la ultraestructura
como lo hace la fijación.
Lo que haces es congelar a muy alta presión y luego
la alta presión impide la formación de cristales de hielo.
Entonces puedes infiltrar la fijación a temperaturas muy bajas.
Esto es conocido como la congelación a alta presión
y es una forma de preservar la ultraestructura del sistema.
Así que lo que necesitábamos era una manera de congelar el sistema
según la resolución de tiempo.
Por eso, inventamos una forma particular de hacerlo,
utilizando pequeños tubos que se usan para la diálisis renal.
Se puede succionar embriones en ellos, se puede seguir el desarrollo
de los embriones en el microscopio,
y luego congelarlos en la máquina de congelación a presión alta,
y luego procesarlos para la tomografía.
Ahora, el problema era que cuando empezamos este experimento,
no era fácil hacer que se congelaran
en el momento que nos interesaba.
Así que utilizamos una máquina nueva, desarrollada por Leica,
lo cual nos permitió hacer tomografía de resolución de tiempo,
y les voy a mostrar esta máquina en acción aquí.
Lo que hemos hecho es que hemos tomado los embriones y los hemos puesto en un tubo.
Supimos que son exactamente del tamaño adecuado y están en la etapa correcta.
Los pusimos en el congelador de alta presión, y ahora los vamos a congelar.
Así que aquí va.
Vamos a meter la mano y vamos a empujarla en el congelador,
y luego ¡poof!, ahora está congelada.
Así que congelamos los embriones rápidamente.
Ahora podemos tomarlos y procesarlos para la tomografía.
Lo clave de la tomografía es que uno mira secciones muy gruesas.
Normalmente, en un microscopio electrónico estándar, se mira a los 50 nanómetros,
pero se pueden ver secciones de 300 nm y se obtiene una imagen en 3D de cómo era.
No voy a entrar en detalles en esta charla. Lo pueden encontrar en otra parte si están interesados.
Pero es una manera de ver una imagen en 3D mediante la microscopía electrónica.
Por lo tanto, podemos ver centríolos en metafase, y podemos ver qué bien se ven.
Se puede ver aquí, por ejemplo, una imagen muy bonita de un centríolo
con microtúbulos alrededor de la parte exterior.
Podemos ver uno aquí.
Por lo tanto, lo que queremos hacer es mirarlos en estas secciones tomográficas.
Como ya he dicho, una de las herramientas principales de un biólogo celular para vincular el fenotipo a la estructura
es la tomografía de electrones.
Es una forma en que realmente podemos obtener una alta resolución estructural del aspecto de las cosas.
Un fenotipo en situ.
Por lo tanto, el problema es que hacemos genética, obtenemos un fenotipo
y queremos saber la forma en que ha cambiado el nivel ultraestructural,
pero por lo general, no se puede aislarlos de la célula y mirarlos.
Más bien, tenemos que mirarlos in situ.
Por lo tanto, lo que voy a mostrar ahora es una tomografía de electrones
de dos centrosomas y centríolos desde el principio, después de la duplicación.
Entonces, lo que vamos a...Estamos pasando a través de la sección.
Van a ver, estamos buscando a un centríolo
con sus microtúbulos, y a continuación vamos a pasar por allá.
Luego, vamos a llegar al otro par de centríolos. Están más o menos a un micrón de distancia.
Y se puede ver lo que hemos hecho allí, en esa tomografía:
hemos reconstruido tanto la distribución de los microtúbulos
como de los centriolos. Uds. pueden ver que hay un par de centríolos duplicados en cada polo del huso.
Entonces dijimos, ahora vamos a volver en alta resolución,
y vamos a tratar de entender cuáles son los intermediarios
en la creación de centríolos, utilizando nuestras técnicas.
Lo que aprendimos allí fue bastante fascinante.
Supimos que el primer paso en la formación del centríolo es la formación de un tubo central.
Eso se puede ver aquí, por tomografía
y por el dibujo al lado. Este tubo pequeño se está formando al lado de este centríolo.
No tiene ningún microtúbulo alrededor del exterior todavía. Es sólo un tubo desnudo.
Lo que sucedió a continuación fue que el tubo se alargó.
Por lo tanto, es el crecimiento de este tubo a partir de lo que se conoce como el centríolo madre.
Eso es lo que hemos aprendido hasta ahora, que los centríolos se duplican por...
se separan en dos componentes individuales
y luego los centríolos hijos crecen a partir de los centríolos madre por la elongación de este tubo.
El siguiente paso fue muy fascinante
porque nos dimos cuenta de que los microtúbulos se asocian alrededor del tubo.
Sin embargo, lo que encontramos fue que los microtúbulos ...
finalmente no van a ser de 9 microtúbulos todo el camino alrededor del tubo.
Pero, en los compuestos intermedios de la formación de centríolos hay menos microtúbulos.
Así que en este caso hay 7 microtúbulos.
Y también tienen longitudes intermedias.
Se puede ver por aquí estos ganchos que encontramos alrededor del tubo interior,
que parecen definir de alguna manera los "nueve-dad" del tubo.
Si miramos una serie de centríolos diferentes, podemos ver los productos intermedios,
así que de alguna manera los microtúbulos se están uniendo al tubo y formando esta simetría de 9 niveles.
Aquí hay un dibujo del proceso.
Uds. pueden ver el alargamiento del tubo y los microtúbulos que se unen desde el exterior
creciendo y formando los microtúbulos alrededor del exterior del tubo.
Ahora, hemos hecho este dibujo con reconstrucciones, por supuesto, de material fijo.
No hemos visto los microtúbulos en crecimiento,
pero lo hemos inferido al ver tantos especímenes diferentes.
Entonces, lo que podemos aprender de esto es que el ensamblaje del centríolo
procede a través de intermediarios estructurales.
Hay un tubo. El tubo crece durante aproximadamente 8 minutos,
los microtúbulos se asocian con el tubo durante aproximadamente 2 minutos
y el centríolo madre se madura durante este proceso. No hablé de eso
en las tomografías, pero el centríolo madre cambia ligeramente durante este proceso.
Así que lo emocionante de este descubrimiento fue que habíamos demostrado que los centríolos
tienen un ensamblaje casi similar a un virus, donde tienen intermedios estructurales
tienen un ensamblaje casi similar a un virus, donde tienen intermedios estructurales
Pero lo que queríamos hacer después era decir, ahora lo que queremos hacer
es encontrar los genes necesarios para ese proceso.
Esa es la morfología...¿cuál es la genética?
¿Cuáles son los genes necesarios para ese proceso particular?
Resultó ser relativamente sencillo
mediante nuestra pantalla ARNi, debido al trabajo de mi director de tesis, John White,
y un post-doc en su laboratorio, Kevin O'Connell.
Para hacer eso, hay que entender un poco sobre la biología de un embrión de C. elegans.
Miren uno de tipo salvaje. Uds. ven el par de centríolos azules.
Ellos vienen con el esperma. Luego se separan y cada polo recibe un centríolo.
Sin embargo, el centríolo se duplica, por lo que tiene un par de centríolos en cada polo.
¿Ven eso? El centríolo azul...el esperma ha traído su par de centríolos.
Está separado, así que miren cada polo
y verán que tiene un centríolo azul de los espermatozoides,
y el naranjo representa el centríolo que se duplicó
durante el proceso de preparar un huso, como mostré en la primera parte de la charla.
Luego miramos la etapa de dos células...sucede lo mismo otra vez.
Veamos qué pasa si se impide la duplicación de los centríolos.
Lo que sucede cuando se hace eso es un fenotipo muy interesante
porque el esperma trae un par de centríolos. La interferencia de ARN,
por razones que no entendemos realmente, no funciona muy bien en el esperma
por lo que eso no es afectado. Luego, los centríolos se separan y se dirigen a cada polo.
Resulta que la duplicación no es necesaria para formar el polo.
Así que, si no duplicas tu centríolo, eso no afecta la mitosis.
Sin embargo, el problema viene en la siguiente división celular
porque a continuación, cada célula tiene un solo centríolo, no dos,
y ahora sólo tiene un huso monopolar.
Así que, por lo general en vez del bipolar, sólo hace un huso monopolar.
Les voy a mostrar unas películas de eso.
Por lo tanto, aquí hay un centrosoma duplicándose al final de
la división celular, y lo pueden ver entrando en dos centrosomas diferentes.
Se ha duplicado y en la etapa de dos células, tiene dos centrosomas,
y están los cromosomas, que también he mostrado aquí.
Así que esa película tiene tanto centrosomas como cromosomas etiquetados.
Ahora, vamos a ver qué pasa cuando la duplicación del centríolo falla.
Bueno, todo se ve muy bien en este momento.
Hemos hecho un huso, todo está dividido.
Pero, lo que pasa con los husos en la etapa de dos células
es que estos hermosos husillos de mitad de tamaño formarán sin un segundo polo.
Un fenotipo realmente precioso.
No puedo dejar de mirarlos...son tan hermosos.
De hecho, lo que hicimos entonces fue volver a nuestra pantalla de ARNi y decir,
¿cuántos genes son necesarios para la duplicación de los centríolos?
Se puede tomar los 800 genes necesarios para la división celular.
Se pueden seleccionar de nuevo por microscopía de fluorescencia
y se puede buscar los que tienen ese fenotipo.
A partir de esa pantalla, resulta que ahora sabemos que hay 5 genes
necesarios para la duplicación de los centríolos hijos.
Al fin y al cabo, también es bastante simple, no hay muchas proteínas requeridas.
Se podría pensar, wow, ése es un proceso complejo.
¿No requiere eso una gran cantidad de genes? Pero, ¡no!
Parece que estos 5, por lo que sabemos, parecen ser suficientes.
Ahora, el análisis de estos genes y una caracterización detallada
fueron publicados en diferentes laboratorios
y he ilustrado algunos de los trabajos aquí.
Y todos esos estudios mostraron lo mismo.
Si se elimina la función de cualquiera de estos genes, se obtiene un huso monopolar,
como he mostrado allá en la fluorescencia.
Y si luego se hace microscopía electrónica, entonces se inhibe la duplicación del centríolo.
Eso es muy interesante.
Hemos identificado un conjunto de genes que sabemos que son necesarios para la duplicación del centríolo.
Pero cuando se hace un estudio como éste, siempre está el mismo problema,
que es, cómo están relacionadas las proteínas con la estructura del proceso?
Hemos realizado dos experimentos diferentes hasta el momento.
Les he mostraron los experimentos estructurales en los que hemos demostrado cómo los centríolos se duplican.
He mostrado la genética, que señala cómo
podemos identificar las proteínas implicadas en ese proceso.
Pero, ¿cómo vamos a vincular las proteínas a la estructura?
¿Cuál aspecto y cuáles proteínas se necesitan y para qué fase de la construcción de esta estructura?
Así que los vinculamos
y eso es lo bueno de hacer esta tomografía de resolución de tiempo al interior del embrión:
ahora podemos volver y mirar a los fenotipos mutantes por tomografía
y preguntar cómo afecta eso la duplicación.
Y cuando lo hacemos, encontramos lo siguiente.
Aquí señalo de nuevo una cronología de duplicación,
y también puse en la parte superior las proteínas.
Es una pequeña jerarquía de organización en la que hay dos proteínas, Spd-2 y Zyg-1,
que se requieren para que todas las otras proteínas pasen a los centríolos.
Ahora, si se saca Sas-5 o Sas-6 de la célula y luego se hace la tomografía de electrones,
tampoco se encuentra una duplicación.
Eso sugiere que Sas-5 y Sas-6 probablemente son necesarios para la formación del tubo central.
Pero, Sas-4 era más interesante en su fenotipo de microscopía electrónica
porque cuando eliminamos Sas-4, todavía se formaba un tubo, pero
que no se formaba ningún microtúbulo alrededor del exterior del tubo.
Eso nos dice entonces que Sas-4 de alguna manera
se requiere para formar los microtúbulos alrededor del tubo.
Déjenme mostrarles una tomografía
de formación en embriones Sas-4 del ARNi.
Se puede ver que la madre está bien,
pero la única hija tiene un tubo sin microtúbulos alrededor.
¿Pueden ver eso aquí? Ese pequeño y púrpuro...
el verde es la madre, y el púrpuro es la hija.
Entonces, eso es lo que concluímos luego de este estudio, que
el conjunto de proteínas se forma en los centríolos que están formándose.
Entonces podemos demostrar que Sas-5 Sas-6 son aparentemente necesarios
para formar el tubo central, y Sas-4 se requiere
para la formación de los microtúbulos alrededor del exterior del tubo.
Por lo tanto, en este estudio, lo que he tratado de mostrar
es otro complejo de proteínas muy intrincado
que se forma a partir de la distribución de las moléculas diferentes.
Eso forma una estructura interesante, que es diferente de los microtúbulos.
Los microtúbulos son polímeros.
Éste parece ser un ensamblaje más similar a los virus,
con pasos en el proceso de montaje que se pueden aislar,
y también podemos encontrar los genes necesarios para ello.
Podemos mostrar, a grandes rasgos, cómo se requieren para diferentes aspectos de la formación del centríolo.
El siguiente paso, por supuesto, será hacer trabajo estructural más detallado
para tratar de comprender cómo afectan las proteínas individuales, por ejemplo,
la formación del tubo.
Por lo tanto, los centríolos, según creemos ahora, se forman mediante un mecanismo viral
con pasos en el proceso de montaje.
Volviendo a nuestra escala, se puede ver que hemos aumentado
en varios grados de magnitud ahora,
a partir de nuestra molécula tubulina inicial, por lo que en realidad estamos viendo estructuras bastante complejas,
que son un par de órdenes de magnitud mayores que las moléculas que las componen.
Así que se puede ver que poco a poco, estamos poniendo la célula en subcompartimentos de organización.
No estamos trabajando con proteínas individuales, pero hacen estas estructuras muy complejas.
Algunos son más como máquinas, por ejemplo lo sribosomas, que hacen las proteínas,
pero otros son más complejos-como...polímeros o como centríolos.
Y pensar en cómo estas cosas se juntan
nos ayuda a comprender la organización de la célula.
Me gustaría dar las gracias a...terminar mediante... por supuesto, la propia genómica es un proceso
muy, muy lento que involucra a muchas personas diferentes.
Sin embargo, algunos de los actores principales se mencionan aquí,
además de los participantes en el ensamblaje del centríolo.