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En el segundo día de nuestro procedimiento ICC vamos a añadir nuestro anticuerpo secundario, realice
un doble etiquetado facultativo y de paso etiquetado nuclear,
montar los cubreobjetos a las diapositivas, y obtener imágenes de nuestros anticuerpos con
un microscopio de fluorescencia.
Primero
que aspirar apagado siguientes anticuerpos primarios solución por lavado de las células
tres veces con PBST durante cinco minutos cada uno.
Siguiente preparar el floraform anticuerpo secundario conjugado que se unirá a
el anticuerpo primario.
Diluir el tampón de bloqueo secundario
a la dilución de recomendaciones especificado en la ficha técnica
e incubar a temperatura ambiente durante una hora.
Cubrir las placas con papel de aluminio evita los tintes sensibles que se degrade.
Aspirar fuera de la solución de anticuerpo secundario seguido por lavado de las células
tres veces con PBST
durante cinco minutos cada uno.
Como un paso opcional un par separado primaria y secundaria se puede utilizar
para visualizar un segundo epítopo mediante el uso de un piso diferente para ella.
Además, los colorantes de unión al ADN tales como DAPI puede ser aplicado sin la necesidad de
anticuerpos secundarios.
Consulte el Protocolo Novus completa por escrito para obtener instrucciones sobre cómo duplicar y
etiqueta triple.
Cubreobjetos ahora está listo para ser montado en portaobjetos de microscopio.
Tomar un portaobjetos limpio y dispensar una gota de medio de montaje Antifade lentamente
marcación hacia abajo el émbolo de la pipeta.
Retire con cuidado el cubreobjetos del pozo,
permitir que el exceso de lavado se escurra
y colocar las celdas hacia abajo en la diapositiva.
Esmalte de uñas transparente se puede utilizar para sellar el cubreobjetos y evitar que se
seque.
Diapositivas ahora puede ser visualizado bajo un microscopio o se almacenaron a -20
o 4 grados Celsius en una caja de portaobjetos oscuro o libro de diapositivas.
Limitar la cantidad de tiempo que cada diapositiva se expone a la luz del microscopio puedan ayudarlos
en la prolongación de la señal fluorescente
y evitar la foto de blanqueo.