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Con las células chapada en el día anterior y durante la noche cultural, estamos listos
para comenzar con el procedimiento de la CPI.
En este primer día de la CPI, vamos a arreglar,
permeabilizar,
borrar y añadir un anticuerpo primario a las células.
Iniciar mediante la aspiración de medio de cultivo de cada pocillo seguido de la fijación de la
las células con formaldehído al 4% o formalina al 10%
durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Aspirar fijador y enjuagar cada pocillo dos veces con PBS enfriado con hielo.
Tenga cuidado de no permitir que las células se secan en este
o cualquier otra etapa del protocolo.
Si el epítopo de la proteína de interés se expresa intracelularmente,
permeabilización celular es necesaria para el anticuerpo para obtener acceso a la
célula.
Aunque hay muchos agentes de permeabilización diferentes, los más comunes
son .1 a .5% de concentración de Tween-20 o
Triton-X100
diluido en PBS.
Tween-20 se utiliza para epítopos localizados en el citoplasma
mientras Triton-X100 se utiliza para permeabilizar el núcleo y las mitocondrias.
Incubar los pocillos con tampón de permeabilización durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Aspirar permeabilización de amortiguación y se lava tres veces durante 5 minutos
cada uno con PBS hilo.
PBS hilo contiene 0,1% de Tween-20.
Ahora vamos a bloquear sitios de unión no específicos con tampón de bloqueo durante 1 hora
a temperatura ambiente.
El tampón de bloqueo se mejor PBST que contenía 10% de suero de la
albergar especies de su anticuerpo secundario.
Sin embargo, 1% de BSA en PBST también se pueden usar.
Preparar el anticuerpo primario por dilución en tampón de bloqueo a la recomendada
dilución especificada en la hoja de datos.
Varias diluciones más estrictos son beneficiosos para tener en cuenta las variables que los
puede ser diferente en su ensayo y
para lograr los mejores resultados.
Incubar a 4 º C durante la noche.
En nuestro ejemplo, ya que estamos utilizando una primaria no conjugada vamos a utilizar un fluoróforo
secundario conjugado con el segundo día.