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Hola, mi nombre es Davis Roos y soy profesor de la Universidad de Pennsylvania en Filadelfia.
En el segundo segmento de esta charla iBio
me gustaría hablar con Uds. sobre el descubrimiento del apicoplast y creo que Uds. verán lo que quiero decir
con este título un tanto caprichoso, "Algo viejo, algo nuevo, algo prestado
y algo verde, no azul". En el último segmento hablamos de
los parásitos de Apicomplexa, un grupo de cinco mil protozoos eucariotas,
que son parásitos intracelulares obligados que viven al interior de las células huésped,
incluyendo los seres humanos y una amplia variedad de otros organismos. Estos parásitos incluyen
los parásitos de la malaria, responsables de cientos de millones de casos de enfermedad a nivel mundial
y del orden de dos millones de muertes cada año. También incluyen Toxoplasma,
un parásito que está aún más extendido, infectando a aproximadamente un tercio de la población mundial
normalmente sin efectos adversos, pero con varias excepciones importantes
a esa regla, incluyendo la importancia de Toxoplasma como un patógeno oportunista
asociado con el SIDA y otros trastornos inmunosupresores, y en particular como
un patógeno congénito, la principal fuente de defectos neurológicos congénitos
en muchas partes del mundo. Esto que vemos aquí es un parásito de la malaria
y la última vez hablamos de los distintos organelos dentro de este parásito.
Vimos el núcleo, los organelos secretores, incluyendo el aparato de Golgi aquí,
y los organelos especializados involucrados en la unión a las células huésped y la invasión.
Hablamos mucho sobre el complejo de la membrana interna, esta doble membrana
que se requiere para el ensamblaje de los parásitos hija dentro de la madre,
en un proceso fascinante conocido como esquizogonia. Estas son células eucariotas
y como tal albergan además de un núcleo la mitocondria, un organelo endosimbiótico
y vamos a decir un poco más sobre la endosimbiosis en general en un momento.
Pero el objetivo de esta charla será en realidad el apicoplasto o el plástido de Apicomplexa,
un organelo con una historia biológica extraordinaria que nos proporciona
información sobre la evolución de las células eucariotas en general y sobre los objetivos potenciales
para el desarrollo de fármacos. De hecho, esta historia tuvo su inicio en historias
no sobre la biología celular de los organelos, sino sobre el mecanismo de acción de los fármacos
y la identificación de objetivos farmacológicos. Todo comenzó hace una década a través de
el trabajo del estudiante de posgrado Maria Fichera, que se interesé en la siguiente pregunta:
¿Por qué estos medicamentos, como el cloranfenicol, clindamicina, azitromicina...
todos bien conocidos como antibióticos antibacterianos, todos bien conocidos como antibióticos eficaces
ya que inhiben la síntesis de proteínas en los ribosomas bacterianos, pero no en los ribosomas humanos.
¿Por qué son eficaces estos compuestos contra los parásitos de la malaria y los parásitos de Toxoplasma?
La clindamicina se utiliza regularmente en la clínica para tratar a los pacientes. Ahora, la propuesta inicial
era que tal vez hay algo bacteriano en la síntesis de proteínas
en los parásitos de Toxoplasma y de malaria, pero María pudo demostrar rápidamente que ése no es el caso.
La síntesis de la proteína citoplasmática no se parece a la bacteriana,
ciertamente no es sensible a estos antibióticos. Aunque fue difícil ver
la síntesis de proteínas mitocondriales, sin duda la función mitocondrial
no se ve afectada por estas drogas. Y sin embargo, estos compuestos matan a los parásitos y de una manera muy peculiar.
Permítenme describir este fenómeno que María define como el fenotipo de la muerte retardada.
Aquí es cómo funciona. Podemos tratar a los parásitos con un máximo de
10.000 veces la dosis letal de drogas. Aquí usamos dos antibióticos diferentes,
un inhibidor de la síntesis de proteínas y una fluoroquinolona
que bloquea la replicación del ADN bacteriano.
Y crecen como si no hubiera mañana durante 48 horas
o 6-8 ciclos celulares, inmersos en decenas de miles de veces la dosis letal de drogas.
Se escapan de la célula huésped, sobreviven extracelularmente, e invaden una nueva célula huésped sin dificultad,
y allí, dentro de esa nueva célula huésped, se mueren o, más precisamente, en realidad no mueren.
Estos parásitos crecen, pero crecen más lentamente,
en una medida determinada por la duración y la concentración
del tratamiento farmacológico que vieron hace 6 ciclos celulares.
Ahora, tengo que confesar que no les puedo dar una explicación para esto,
pero este fenómeno muy peculiar es una característica de todos estos compuestos,
compuestos estructuralmente relacionados, que tienen en común
sólo el hecho de que inhiben la transpeptidación en los ribosomas bacterianos.
Eso hizo muy poco probable que estos medicamentos tuvieran
actividades inusitadas en parásitos de la malaria, lo que sugiere que deben
inhibir la síntesis de proteínas, pero no la síntesis de proteínas que conocíamos.
Eso llevó nuestra atención a una serie misteriosa de ribosomas que se identificaron
hace muchos años, hace muchas décadas, tanto en los parásitos de Plasmodium como los de Toxoplasma.
En un ADN episomal, un ADN circular de 35.000 nucleótidos que originalmente se consideró
el genoma mitocondrial de los parásitos, pero cuando el verdadero genoma mitocondrial
fue descubierto en los parásitos de la malaria y más tarde en otros parásitos de Apicomplexa,
este círculo de 35 kb quedó como un misterio de la biología molecular,
un misterio sin función, sin hogar. Pero la única cosa que sabíamos al respecto,
a partir del trabajo realizado principalmente por el laboratorio de Ian Wilson en el Reino Unido, fue que estos ADN
contienen genes ribosomales, y que además esos genes
tienen secuencias características que sugieren que podrían ser susceptibles a los antibióticos macrólidos,
medicamentos como los que vimos antes. Así que para investigar esto más a fondo, clonamos
y secuenciamos la secuencia completa de estos genomas de parásitos
aprovechando marcos predichos de lectura abierta,
en particular el del factor de elongación, el gen Tu, un gen muy ampliamente utilizado
que se conoce como importante durante toda la vida, podemos empezar a obtener
una idea de lo que podría ser este ADN episomal misterioso. Esos estudios
produjeron varios resultados, el primero de los cuales fue que todos los
Apicomplexa, Plasmodium, Toxoplasma y el patógeno aviar Eimeria son monofiléticos,
forman un solo grupo y eso, por supuesto, no fue una sorpresa en absoluto.
El segundo fue que en el mundo de las bacterias, en la región de aquí hacia abajo,
las secuencias no se parecen para nada a los genomas mitocondriales indicados en amarillo,
hacia abajo en la parte inferior de la pantalla. De hecho, se ven más relacionadas
a las cianobacterias, algas azul-verdes, de hecho, el ancestro de los cloroplastos en plantas y algas.
Esto tampoco fue una gran sorpresa porque nosotros y otros ya habíamos notado anteriormente
que este ADN episomal tiene muchas similitudes con el ADN del cloroplasto.
Por eso, sospechamos que tal como el antepasado de todas las plantas y algas adquirió
un organelo de un alga azul-verde, la cianobacteria, dando lugar a los cloroplastos modernos,
de manera similar estos parásitos podrían haber adquirido otro endosimbionte cianobacterial,
dando lugar a un nuevo organelo. Pero la mayor sorpresa
fue que estos parásitos no son sólo un poco parecidos los cloroplastos asociados
a las plantas y algas, sino que se parecen mucho, como si no hubiéramos clonado un poco de
ADN de parásito, sino que hubiéramos contaminado nuestros cultivos inadvertidamente
con un poco de espuma de la laguna fuera de nuestro laboratorio. Pero no, no
contaminamos los cultivos, esto es realmente ADN de parásito
que se ve como si viniera de una planta. Así que esto plantea una especie de paradoja
porque sabemos mucho acerca de la evolución de estos parásitos.
Sabemos a ciencia cierta que no son plantas y algas, que divergieron de los linajes eucariotas comunes
mostrados aquí a la izquierda, antes de la divergencia de los animales y los hongos,
probablemente antes de la divergencia de los animales, hongos y plantas. Están más estrechamente relacionados
a ciliados como el paramecio y a dinoflagelados como los organismos que causan
la marea roja y el veneno de la industria de los mariscos. Sin embargo, albergan lo que parece ser un cloroplasto de planta.
Hay realmente una sola solución posible a esta paradoja
y proviene de considerar el fenómeno de la endosimbiosis.
Ahora es bien conocido y universalmente aceptado que prácticamente todos, tal vez todos los eucariotas
albergan una mitocondria o en un momento albergaron una mitocondria
que se perdió posteriormente. Esamitocondria se adquirió
por un evento de transferencia horizontal cuando el antepasado de todos los eucariotas se comió una bacteria,
una alfaproteobacteria, de hecho, dando lugar al ancestro de la mitocondria,
rodeada por una doble membrana y que contiene ese genoma mitocondrial.
Del mismo modo, sabemos que el ancestro de todas las plantas y algas adquirió una cianobacteria
por un evento similar de transferencia horizontal, una invasión del antepasado
o un atrapamiento de la bacteria, dependiendo de su perspectiva,
dando lugar al cloroplasto, un organelo distintivo, de nuevo, rodeado por una
doble membrana y que alberga el ADN adquirido a partir de ese ancestro cianobacterial.
Por eso, o todo lo demás que creemos saber sobre el origen de estos parásitos
está mal y de hecho el Apicomplexa se ramifica del linaje de las plantas,
o en vez de eso quizás simplemente recogieron un poco de linaje de plantas por transferencia horizontal,
como se indica en este diagrama. El proceso de endosimbiosis secundaria
sostiene que un parásito ancestral comió un alga eucariota, que había adquirido previamente
un cloroplasto por engullir una cianobacteria. Estos parásitos han
mantenido ese organelo plastidio a pesar de haber prescindido
de la mayoría de las funciones que consideramos asociadas a los cloroplastos: la fotosíntesis, por ejemplo,
no tiene lugar en los parásitos con los que trabajamos. Aquí hay una versión animada
que los viejos aficionados de videojuegos podrían considerar
como el modelo Pacman de la evolución del organelo, donde un eucariote ancestral
comió un alga unicelular, dando lugar al cloroplasto, rodeado por una doble membrana.
Luego viene el ancestro de estos parásitos y engulla
esa planta o alga eucariota, dando lugar a los parásitos de la Apicomplexa moderna,
que albergan un organelo endosimbiótico, que sabemos que es esencial
como objetivo para estos diversos fármacos. De acuerdo con este modelo,
el organelo que ahora conocemos como el plastidio de Apicomplexa
o apicoplasto está rodeado por cuatro membranas, lo cual podemos ver en estos parásitos de Toxoplasma,
organelos distintos del aparato de Golgi, la mitocondria y el núcleo.
Ahora, Uds. podrían preguntarse cómo un organelo tan sorprendente fue ignorado
por los biólogos celulares durante todos estos años, y la respuesta, por supuesto, es que no fue ignorado
en absoluto. Este organelo fue visto muchas veces y fue objeto de mucho debate,
pero fue dado una variedad de nombres poco informativos: el cuerpo esférico,
el complemento de Golgi, o dependiendo de su afinidad lingüística,
en Francia fue llamado el organelo plurimembranaire, en Alemania, el Hohlzylinder.
Pero lo que podemos decir ahora es que la respuesta a este misterio de la biología celular,
(¿qué es este organelo y es un organelo distinto), es la misma que la respuesta
a nuestro misterio de la biología molecular (¿qué es este ADN episomal?),
y la respuesta a nuestro misterio farmacológico (¿cómo es que estos fármacos,
normalmente activos sólo contra especies bacterianas, son activos contra organismos como Toxoplasma y Plasmodium?)
Así que el apicoplasto o el plastidio de Apicomplexa es un organelo novedoso adquirido
por endosimbiosis secundaria, que alberga su propio genoma y es esencial para la supervivencia del parásito,
todo un hallazgo emocionante. No es todos los días que se descubre un nuevo organelo,
pero la gran pregunta, por supuesto, es ¿qué hace el apicoplasto? Ahora, ya hemos
clonado su genoma, secuenciado en su totalidad, sabemos cada gen asociado
con ese organelo o genoma: 30 genes que codifican proteínas,
otros 30 genes de ARN que codifican ARN ribosomal y ARN de transferencia. Pero desafortunadamente,
ese genoma organelolar que fue tan informativo sobre el origen
del apicoplasto, sobre el mecanismo de acción de fármacos como
fluoroquinolonas, macrólidos y rifampicinas contra estos parásitos
no es informativo en absoluto sobre lo que suponemos deben ser
las funciones metabólicas que hacen que sea esencial para la supervivencia del parásito. Y eso probablemente
no debería ser una gran sorpresa porque sabemos que todos los organelos endosimbióticos,
los cloroplastos de las plantas, las mitocondrias de los eucariotas en general,
codifican algunas proteínas en su propio genoma pero la mayoría de las proteínas asociadas
a su función en realidad se han transferido al genoma nuclear
y se traducen en ribosomas citoplasmáticos, y después de la traducción
importados en los organelos. Así que si vamos a obtener una idea
de las vías metabólicas y de si ellas podrían ser el objetivo
para el tratamiento con antibióticos, entonces vamos a tener que mirar
el genoma nuclear de estos mismos organismos.
Podemos hacerlo y podemos encontrar esos genes, podemos filtrar las secuencias del genoma disponibles
en ese momento un número bastante limitado de genes. Se pueden identificar
proteínas asociadas con los ribosomas, una proteína ribosomal S9, por ejemplo,
es una proteína esencial para la función de la proteína ribosómica que es fácilmente
identificable como de tipo bacteriano o de tipo eucariota. En este gen particular
posee una larga extensión amino terminal en el gen predicho, lo que sugiere
que podría haber información de objetivo que es responsable de la translocación
a través de esas múltiples membranas del apicoplasto. De hecho, en el trabajo realizado
en el laboratorio de mi colega en Australia, Ross Waller, un estudiante de posgrado,
Jeff McFadden en Melbourne, cultivó anticuerpos para estas proteínas y mostró
en Western blot que de hecho se unen a las proteínas de un peso molecular consistente
con la conversión de este gran precursor en una versión más pequeña,
que sería la proteína ribosomal madura. Lo mismo es cierto para otras proteínas,
para Toxoplasma y Plasmodium. Ahora bien, esto nos da las herramientas que necesitamos
para poder explorar no sólo lo que estas proteínas podrían estar haciendo...sin duda
ya sabíamos que había ribosomas asociados con el apicoplasto, no es tan sorprendente
encontrar ribosomas codificados en el núcleo e importados al apicoplasto...
pero esto nos da herramientas que podemos utilizar para explorar cómo las proteínas podrían transitar
por esas múltiples membranas de los organelo. Sabemos que las proteínas
están, de hecho, dirigidas a los organelos, y sabemos eso a partir de experimentos de hibridación in situ,
estudios de unión realizados en muestras fijas en el laboratorio del Dr. McFadden.
Podemos ver en Toxoplasma y Plasmodium, en parásitos vivos fusionados
a un reportero de la proteína fluorescente, que las proteínas se dirigen al apicoplasto
en el extremo apical del núcleo parasitario. En Plasmodium podemos observar el proceso
de la replicación, donde un párasito de la etapa anillo se acerca a este esquizonte segregante
que luego estallará como 16 merozoitos hija a través de esta
notable estructura que media la segregación de los organelos entre las
varias hijas. Un ejemplo aún más extremo en el trabajo recién realizado
por Boris Striepen en la Universidad de Georgia, podemos ver la segregación
del apicoplasto en otro parásito de Apicomplexa, Sarcocystis neurona,
un patógeno importante de los caballos, ya que es segregado entre las numerosas hijas
que se están desarrollando en esos parásitos. Podemos trazar las señales de direccionamiento,
que son las responsables de esto, en mucho más detalle por la genética molecular de cortar y pegar.
Cuando miramos la larga extensión N-terminal, sospechada de mediar la orientación
al apicoplasto, podemos ver que realmente lo hace: si tomamos la extensión apical de una proteína
y cortamos la parte madura de la proteína indicada aquí en amarillo,
y la fusionamos a un reportero de proteína fluorescente, entonces entra en el apicoplasto.
Pero la propia señal N-terminal no se parece mucho a la clásica señal de direccionamiento del cloroplasto
de hecho, su extremo N-terminal no se ve nada parecido
a una señal de direccionamiento del cloroplasto, sino que parece una secuencia de señales secretoras,
la señal responsable de la secreción de enzimas pancreáticas, por ejemplo,
en el intestino delgado. En efecto, si tomamos esa pequeña región N-terminal,
la región hidrofóbica que se indica aquí en azul, y la fusionamos a un reportero de proteína fluorescente,
entonces se comporta como una secuencia de señales secretoras: secreta una proteína fluorescente
fuera del parásito. Se pueden ver cuatro parásitos de Toxoplasma aquí, silueteados en ***.
El resto de esta larga extensión N-terminal no media ningún objetivo por sí misma,
como vemos en estos parásitos, bien manchados en el citoplasma. Sin embargo, esa región
puede ser reemplazada con una genuina señal de direccionamiento del cloroplasto a partir de una planta de guisante
o del organismo experimental, Arabidopsis. De hecho, podemos hacer una proteína de plastidio, codificada, nuclear y
completamente sintética, al tomar una secuencia de señales del páncreas,
fusionarla a un dominio de focalización del cloroplasto que viene de guisantes,
fusionar eso con una proteína fluorescente derivada de una medusa, y ¡bingo!
Va directamente al apicoplasto tanto en Toxoplasma como en Plasmodium.
Así que ante el gran problema de cómo dirigir proteínas hacia estos organelos,
estos parásitos han desarrollado un mecanismo extraordinario. Fusionando lo que normalmente
consideramos vías de focalizacióncompletamente distintas, lo azul,
la secuencia de señales de secreción, con lo verde, un dominio de direccionamiento de plástidos,
podemos trazar la naturaleza de esas señales de direccionamiento de plástidos en gran detalle.
En estos experimentos, llevados a cabo por el investigador postdoctoral Omar Harb,
podemos distinguir entre las proteínas que se dirigen al apicoplasto
y aquellas que se dirigen a la membrana del apicoplasto y no al lumen, que se muestra aquí en rojo.
Podemos seguir el procesamiento de esas proteínas en western blots a medida que la señal de direccionamiento se escinde.
Podemos seguir a las que han perdido la capacidad de dirigirse al apicoplasto pero que aún albergan
las secuencias de señales secretoras, y las que han perdido toda la información de destino también.
Sabemos que el direccionamiento a los cloroplastos de las plantas y el direccionamiento al apicoplasto
de estos organismos es bastante complejo e implica una variedad de señales redundantes.
Para esta señal de direccionamiento particular, hay, de hecho, uno, dos, tres
señales de direccionamiento de plástidos completamente distintas, cualquiera de las cuales es suficiente
para mediar el direccionamiento a los organelos. Así que en una historia bastante inusual,
muy diferente de la que han aprendido en la biología celular introductoria,
tomamos dos señales de direccionamiento, normalmente consideradas muy distintas:
la secuencia de señales secretoras, que media la translocación co-translacional
por el retículo endoplásmico, donde a la señal
peptidasa procesa la secuencia de la señal, lo rosado,
para exponer un dominio subterminal, lo amarillo, considerado normalmente
una señal de direccionamiento postraduccional que media la translocación
por la membrana del cloroplasto. Ahora esta parte amarilla se expone
dentro del lumen del retículo endoplásmico y mientras esa proteína
serpentea por la vía secretora, media la translocación por
el resto de las membranas en el apicoplasto, donde una proteasa de pitrilisina
escinde eso para exponer la proteína madura, que se indica en verde.
Sabemos que este proceso pasa por la vía secretora clásica
a partir de varios estudios llevados a cabo por Manami Nishi en este único experimento.
Usamos un estudio de fotoblanqueamiento de fluorescencia para seguir la temporización del direccionamiento
al apicoplasto, en este caso dos parásitos etiquetados en rojo
con un marcador para el complejo de la membrana interna y el apicoplasto etiquetado
en verde. Hemos fotoblanqueado un apicoplasto justo antes de la división del parásito
y se darán cuenta de que se recupera por la producción de nuevas proteínas
muy rápidamente, dentro de unos pocos minutos. Luego tomaremos las mismas células
y fotoblanquearemos el otro apicoplasto aquí, y ahora esto se ha hecho
justo cuando comienza la replicación del parásito, después de la división
del aparato de Golgi. Aquí se pueden ver los parásitos hija en desarrollo
dentro de la madre, mientras que ahora se replican y se extienden durante más de 80 minutos.
No hay ninguna recuperación de la proteína llevada al apicoplast. De hecho, cinco horas más tarde
todavía no vemos ninguna proteína dirigida al apicoplasto y no lo haremos hasta que esos parásitos
comiencen a dividirse de nuevo. El traslado al apicoplasto se produce sólo durante esta ventana de tiempo
muy estrecha, indicada aquí con los triángulos blancos mientras el apicoplasto
está a su vez dividiéndose y mientras el aparato de Golgi está dividiéndose
y está lo más activo. Podemos ver este proceso y los organelos
que están involucrados en una micrografía electrónica con grandes vesículas distintivas:
aquí están las oscuras vesículas densas en electrones, distintas de las vesículas COPI y COPII
asociadas con el tráfico desde y hacia el aparato de Golgi.
De hecho, en estas vesículas más grandes podemos teñir las proteínas destinadas al apicoplasto.
Pero planteo este problema no como una problema biológico celular del direccionamiento distintivo
al apicoplasto, sino como un problema de
importancia fundamental, si es que estamos interesados en identificar objetivos para la supervivencia de parásitos.
Recuerden que éste es un organelo esencial, lo más probable es que albergue una gran variedad
de funciones metabólicas. ¿Cuáles son esas funciones y podemos focalizarlas
con los nuevos medicamentos? Ahora se pueden imaginar una variedad de estrategias
que se podrían usar para explorar las funciones de un organelo novedoso.
Sabemos mucho sobre la función de los cloroplastos, por ejemplo,
y sabemos eso mediante estudios enzimológicos, por ejemplo, sobre cloroplastos purificados,
pero aquí sufrimos por la dificultad de obtener
un gran número de parásitos. Si trabajáramos con los cloroplastos de las plantas de guisantes,
o plantas de espinaca, podríamos ir al mercado o al campo y comprar
un camión lleno de espinacas y aislar gramos o kilogramos de cloroplastos
para estudios enzimológicos. Del mismo modo, si estuviéramos interesados en usar enfoques proteómicos
más modernos, desearíamos tener grandes cantidades de material.
Sin embargo, para estos parásitos, podemos obtener a lo máximo un gramo de parásitos
y por supuesto el organelo de plástido va a ser sólo una pequeña fracción de ese gramo.
Podemos imaginar otros enfoques: podríamos diseñar pruebas genéticas,
saturar el genoma del parásito con transgenes de inserción y quizás
seleccionar los genes que han adquirido la señal de direccionamiento de plástidos en virtud
de las pruebas para el direccionamiento al apicoplasto. De hecho, hemos utilizado todos
esos enfoques, estudios enzimológicos, proteómicos, genéticos,
en mi laboratorio y en otros. En suma,
hemos aprendido un poco sobre la función del apicoplasto,
hemos identificado algunos candidatos viables, pero el enfoque más exitoso
por el momento ha sido el de la informática, y me gustaría tratar de describirlo
para Uds. brevemente. Esta ilustración indica lo que Uds. pueden imaginar
como un esquema conceptual, una estrategia para identificar proteínas del apicoplasto
nuclearmente codificadas al minar las bases de datos del genoma. Vamos a ir a las
secuencias del genoma que están disponibles, cualquier secuencia, completa,
incompleta, secuencias del genoma, secuencias de EST de cualquier organismo que tiene un apicoplasto.
Vamos a visitar esas secuencias haciendo varias
preguntas muy simples. Preguntar por ejemplo, por cualquier gen
que muestre cierto nivel de similitud con las proteínas conocidas por estar asociadas
con plantas o con los cloroplastos. Ahora, habrá mucho,s muchos
positivos falsos en este tipo de búsqueda. Muchas proteínas se asocian
con los cloroplastos de plantas, pero no necesariamente con el apicoplasto.
Habrá falsos negativos, proteínas que simplemente
no podemos reconocer porque son demasiado divergentes. Del mismo modo, podemos buscar
proteínas que tengan una o otra señal de direccionamiento distintiva,
podemos buscar proteínas con una secuencia de señales de secreción, por ejemplo.
Pero una vez más, tal vez no podamos identificar todas las secuencias de señales,
particularmente en organismos para los que la estructura de los genes no está bien caracterizada.
Por otra parte, al buscar secuencias de señales, sin duda
vamos a identificar las proteínas destinadas al retículo endoplasmático
o el aparato de Golgi, o los organelos secretores que son importantes para la invasión,
o la membrana plasmática, o la vacuola parasitófora, o la célula huésped más allá.
Así que falsos positivos, falsos negativos, y de manera similar para todas las diversas
pruebas que pensamos llevar a cabo. Pero yo sugeriría que todas las pruebas que aparecen en esta tabla
tienen dos características en común, y las
tienen en común con todos los enfoques computacionales exitosos.
La primera es que son irremediablemente no específicos, pero la segunda es que
son todos computacionalmente tratables y por lo tanto fáciles de hacer. Si hacemos
una búsqueda así, identificamos muchas proteínas con secuencias de señales secretoras
o con similitud a las plantas o cianobacterias, o con extensiones N-terminales.
Pero lo que estamos buscando son los candidatos que alberguen dos o idealmente tres
de esas cosas, y en nuestra primera serie de pruebas identificamos varios
cientos de proteínas que podrían estar asociadas con el apicoplasto.
Un solo enfoque, un enfoque informático, sin duda muchos
ejemplos falsos, pero sin duda unas hipótesis que podemos probar experimentalmente en la mesa del laboratorio.
Así está como se ve una de esas proteínas, una proteína con una secuencia N-terminal
de señales hidrofóbicas, una región subterminal rica en
aminoácidos cargados, una de las características del direccionamiento del plastidio,
al menos en los parásitos de Plasmodium, aunque los parásitos de Toxoplasma se ven
un poco diferentes. Y lo más importante en este caso, una región N-terminal
que muestra similitud inequívoca a ferredoxina, el aceptor terminal de electrones
en la fotosíntesis. Mientras estos parásitos no están
fotosintéticamente activos, han retenido dos proteínas,
restos vestigiales de la fotosíntesis en el ancestro de los apicoplastos.
Aquí hay otro ejemplo proteínas, reductasa de ferredoxina NADP.
En este caso, tomamos esta proteína, la fusionamos a un
reportero de proteína amarilla fluorescente, la transfectamos en parásitos de Toxoplasma.
Ahí podemos llevar fácilmente a cabo estudios de transfección transitoria en un experimento de noche
con proteínas derivadas de Plasmodium o Toxoplasma.
Podemos demostrar por la co-localización con una proteína de apicoplasto validada
que efectivamente esta proteína está dirigida al apicoplasto.
El resultado neto de estos estudios es lo que creemos que es un mapa completo de vías metabólicas
para el apicoplasto. Sabemos que este organelo alberga su propio ADN
y la maquinaria necesaria para replicarlo. Alberga su propia maquinaria transcripcional
y esas transcripciones se traducen en proteínas usando proteínas codificadas
en el genoma del apicoplasto y proteínas adicionales que se importan desde el núcleo.
Ahora sabemos mediante proteínas codificadas en el núcleo que están asociadas
con el apicoplasto, que varios otros procesos metabólicos
también tienen lugar dentro de las cuatro membranas del apicoplasto.
Sabemos que este organelo está implicado en la biosíntesis de lípidos, utilizando una sintetaza de ácidos grasos
que es significativamente diferente de la sintetaza de ácidos grasos
de las células animales y humanas en particular. La sintetaza de ácidos grasos del tipo II
consta de múltiples subunidades que se ensamblan en un proceso
que es el objetivo de los antibióticos antimicrobianos eficaces,
que podrían ser candidatos para el tratamiento de la toxoplasmosis o la malaria.
Sabemos que el apicoplasto lleva a cabo la biosíntesis de isoprenoides,
los precursores del colesterol, aunque en este caso no se convierten
en unidades isoprenoides de colesterol, se utilizan sin duda para modificar
la transferencia de ARN y posiblemente para otras funciones también.
Sabemos que la ruta de biosíntesis del hemo implica no sólo
el citoplasma y la mitocondria asociada en la vía C-4 heme estándar,
en, por ejemplo, células de mamíferos, sino también el apicoplasto, en un proceso interesante
que no entendemos todavía en mucho detalle. Podemos ir más profundo y llegar
a más detalles para identificar todos los diversos componentes asociados
con estas vías, incluyendo varios que son especialmente atractivos
como objetivos para fármacos, algunos de los cuales tienen compuestos que están ahora en ensayos clínicos
como medicamentos contra la malaria. Pero lo que me gustaría señalar hoy
no es sólo que los parásitos de la malaria robaron un plastidio de una planta ancestral,
y mantuvieron ese plásmido como un organelo no fotosintético
que es esencial para la supervivencia del parásito y por lo tanto es atractivo como objetivo terapéutico.
Aunque eso es cierto, el verdadero punto principal
y lo que me gustaría que Uds. aprendieran de este segmento de la charla iBio
es que estos enfoques computacionales bioinformáticos, de obtener datos,
son los que han tenido más éxito y realmente están transformando la forma en que
hacemos experimentos biológicos en este área de la parasitología,
como en todas las áreas de la investigación biomédica. En el próximo segmento de esta charla iBio
vamos a hablar un poco más sobre eso, aprovechando las secuencias del genoma de los párasitos de malaria,
que ahora están disponibles, así como los vectores de mosquitos
y los huéspedes humanos. Vamos a plantear el desafío de si podemos diseñar
y obtener bases de datos para tomar los genomas, identificar los genes,
y desarrollar diagnósticos y terapéuticos, medicamentos y vacunas
que podrían ser eficaces contra estos organismos. Espero
darles más información sobre esto en el próximo segmento de esta serie de conferencias.