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En este vídeo tutorial os mostraremos cómo realizar una electroforesis discontinua
en geles de poliacrilamida / bis-acrilamida en presencia de SDS
según el método de Laemmli
en primer lugar
el cristal superior se sitúa sobre el separador
y ambos se fijan con el soporte
de esta forma queda un espacio entre ambos de unos 0,75 milímetros
al tratarse de un electroforesis discontinua
primero preparamos el gel separador
añadimos agua destilada
el tampón del gel separador con un pH de 8,8
la mezcla de acrilamida / bis-acrilamida al 30%
y el SDS
que nos permite dotar a las proteínas de una relación carga/masa constante
la polimerización del gel se inicia añadiendo persulfato amónico, un generador de
radicales libres
y por último el reactivo de TEMED
que completa la polimerización
la mezcla debe agitarse bien, para una completa homogeneización
una vez homogénea, se añade al espacio que queda entre los cristales
la mezcla debe ocupar aproximadamente una tercera parte del volumen total
en la parte superior se añade una fina capa de agua con el fin de evitar el
contacto de la mezcla con el aire favoreciendo así su polimerización
al poco tiempo nuestra mezcla de gel separador habrá polimerizado completamente
en este momento podemos retirar el agua que nos ayudó a aislar el gel de las condiciones oxidativas del aire
El gel separador está listo
A continuación preparamos el gel concentrador
de la misma forma que previamente preparamos el gel separador
las proporciones de los componentes cambian para generar un tamaño de poro
mayor
pH también se reduce a 6,8
El gel concentrador se sitúa en la parte superior y su función es la de
concentrar las proteínas antes de su separación
finalmente colocamos el peine
esta pequeña pieza de plástico nos permite dar forma a los pocillos dónde
cargaremos las muestras, de esta forma el sistema discontinuo está terminado
con gel concentrador en la parte superior y el separador en la parte inferior
el gel se sitúa en una serie de soportes que nos permite fijarlo a
la cubeta de electroforesis
el soporte central contiene los electrodos que nos permitirán
suministrar corriente eléctrica al sistema
una vez en contacto con el tampón de electroforesis
una vez en la cubeta
se añade el tampón de electroforesis de tal forma que cubran la totalidad del gel
el peine se retira para acceder a los pocillos y cargar las muestras
Esta pieza amarilla es una guía que nos permite identificar, una vez situada en la
parte superior
la posición de los pocillos
con la posición de los pocillos podemos cargar nuestras muestras en el lugar
indicado
las muestras deben ser preparadas en presencia del llamado tampón de carga
este tampón contiene entre otras cosas, glicerol, que permite aumentar
la densidad de la muestra y que ésta se depositen el fondo del pocillo inundado
además contiene un colorante el azul de bromofenol
que nos indicarán la posición de las muestras durante la electroforesis
Una vez cargadas las muestras
retiramos la guía y conectamos los electrodos a una fuente eléctrica
seleccionamos el voltaje adecuado
e iniciamos la electroforesis
el campo eléctrico generado por la fuente de corriente hace migrar las
proteínas cargadas negativamente gracias al SDS
desde la parte superior a la inferior del gel
produciéndose en este trayecto su separación por tamaño
una vez terminada la migración
apagamos la fuente de corriente y retiramos el tampón de electroforesis
que cubre el gel en la cubeta
a continuación retiramos el gel de los soportes de fijación a la cubeta de
electroforesis
lavamos el gel con abundante agua para retirar los restos de tampón que podría
interferir en el proceso de tinción
ayudándonos de una cuña separamos los dos cristales para acceder al gel situado en su interior
lavamos nuevamente con agua
para retirar cualquier resto de tampón
retiramos cuidadosamente el gel del cristal
evitando que éste se rompa en el proceso
añadimos el gel a un recipiente con solución de tinción suficiente para
cubrirlo en su totalidad
esta solución contiene Azul de Coomassie
un reactivo capaz de teñir las proteínas de forma específica
el gel debe incubarse en esta disolución el tiempo suficiente para que tenga lugar
la tinción
normalmente bajo agitación
basta con unas horas para completarla
una vez completada la tinción retiramos la solución colorante con cuidado de no
perder el gel en el proceso
el gel debe verse completamente azul en este momento
lavamos con agua abundante
y varias veces, para retirar toda la solución de tinción no fijada en el gel
los lavados con agua no eliminan el el color azul fijado en el interior del gel
por esta razón es necesario incubar el gel en una segunda disolución
la disolución decolorante
esta disolución elimina el colorante que no se ha unido de forma específica a
las proteínas separadas en la electroforesis
después de incubar el gel varias veces con la solución de colorante, podemos
empezar a distinguir las bandas correspondientes a las proteínas
separadas en la electroforesis
la migración de las proteínas en el interior del gel es inversamente
proporcional a su tamaño
a menor tamaño
mayor migración, es decir más cerca de la parte inferior del gel
con ayuda de patrones de peso molecular podemos identificar las proteínas
presentes en nuestras muestras