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Después de la electrotransferencia de nuestras proteínas a una membrana, que ahora bloquea el
borrar,
aplicar un anticuerpo específico primario para nuestra proteína de interés y, a continuación un anticuerpo secundario
que reconocerán el anticuerpo primario.
Comience retirando la membrana de la casete y enjuagado tres veces en
agua.
Como paso opcional, se puede verificar que las proteínas se transfirieron con éxito
por tinción de la membrana con rojo Ponceau.
Incubar la membrana en ponceau durante cinco minutos y lavar con agua hasta
las bandas son claras.
Después de verificar la mancha puede ser de-manchado al continuar lavar con
agua o cordel TBS hasta que el colorante se elimina por completo.
Tenemos que bloquear todas las áreas de la mancha que aún no contienen proteínas.
Esto evitará que la unión no específica del anticuerpo y reducir global
la señal de fondo.
Tampones comunes de bloqueo incluyen 5% de leche sin grasa seca para el ensayo
en una solución de TBS hilo.
Sin embargo, no use leche al sondear con anticuerpos fosfo específicos como puede
causar fondo elevada, de su fosfoproteína endógeno, cesio.
Incubar la membrana con solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente
bajo ligera agitación.
Decantar la solución de bloqueo y lavar con TBS hilo durante cinco minutos.
Ahora estamos listos para agregar nuestro anticuerpo. Diluir el anticuerpo primario en un
tampón de bloqueo a la concentración recomendada en la hoja de datos.
Incubar durante una noche a 4 grados Celsius con agitación suave.
Un paso opcional recomendado es usar también un control positivo anticuerpo cargado
lo que permite al usuario verificar cantidades iguales de proteína total se cargaron en cada
pozos y los ayudantes en la solución de problemas mediante la eliminación de las incertidumbres
con el procedimiento de Western Blot. El día siguiente, decantar el anticuerpo primario y
lavar la membrana con grandes volúmenes de TBS bramantes y agitación vigorosa
cinco veces durante cinco minutos cada uno.
Estos lavados rigurosos son extremadamente importantes para la eliminación no específica
señales de fondo.
Después del lavado, diluir el anticuerpo secundario en solución de bloqueo y
incubar la membrana durante una hora a temperatura ambiente en la concentración
recomendado en la hoja de datos.
En nuestro ejemplo el secundario es también conjugado con HRP para más tarde
detección.
Decantar y lavar la membrana secundaria con grandes volúmenes de TBS con guita
agitación vigorosa cinco veces durante cinco minutos cada uno. Ahora está listo para la
detección de fase.