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Bienvenidos a la segunda conferencia de la serie
llamada Glycobiología Química.
Mi nombre es Profesora Carolyn Bertozzi.
Estoy en el departamento de Química de la Universidad de California en Berkeley,
también con un puesto en el Departamento de Biología Molecular y Celular,
y además soy investigadora del Instituto Médico Howard Hughes.
Esta es la segunda parte de una serie de dos partes.
La primera parte se centró en el trasfondo y la historia
del campo de la glicobiología y las estructuras de azúcares.
Y esta parte, que es la segunda, se va a centrar más
en algunas investigaciones recientes de mi propio laboratorio en Berkeley
con la meta de obtener imágenes del glicoma.
Y de hecho, lo que estamos viendo aquí es
una imagen de fluorescencia de un pez cebra
de cinco días de edad en el que algunos de los azúcares han sido etiquetados
con moléculas fluorescentes y esto nos permite literalmente visualizar esos azúcares
en un organismo vivo. Déjenme contarles
por qué estamos interesados en eso.
Bueno, ahora el campo de la imagen molecular es grande
y está en rápida expansión, y es muy importante
tanto en la medicina clínica
como en el laboratorio de investigación.
Muchos de Uds. se habrán acostado en una mesa como ésta
en algún momento de sus vidas, al igual que yo.
Este es un escáner de imagen de resonancia magnética, o un escáner MRI
y lo que puede hacer este escáner
es literalmente tomar una foto de las moléculas
en el interior de nuestro cuerpo sin que nos abren quirúrgicamente
lo cual es muy conveniente para muchos de nosotros.
Hay dispositivos muy similares a éste, que permiten a los
médicos mirar otras moléculas en nuestros cuerpos,
moléculas que están radiomarcadas, por ejemplo.
Y eso es lo que se ve en esta imagen. Esto es el escáner PET (tomografía por emisión de positrones):
un cuerpo humano es inyectado con una versión de la glucosa radiomarcada.
Ahora bien, éstas son herramientas importantes para mirar moléculas en entornos clínicos,
pero también nos gusta mirar las moléculas en entornos de investigación,
en particular para entender lo que las moléculas están haciendo al interior de
las células vivas, y hoy en día tenemos unas herramientas
maravillosamente avanzadas para la microscopía de fluorescencia
que nos permiten ver no sólo las colecciones de moléculas en las células,
sino también las distintas moléculas fluorescentes.
Así que es un momento muy emocionante para hacer imágenes moleculares en sistemas vivos.
Ahora, mencioné en mi primera conferencia que uno de los aspectos
más interesantes de la glicobiología es el hecho de que
el glicoma o la colección completa de glicanos que una célula hace
sea dinámica. No es fija.
El glicoma, o la colección de azúcares en la superficie de una célula
cuando ésta está en cierto estado,
es diferente de la colección de azúcares en esa misma célula
cuando la célula ha transformado su estado.
Este es ciertamente el caso cuando las células madre embrionarias
eligen un destino de diferenciación
y luego se convierten en una célula diferenciada,
como una célula muscular o una neurona. Si nos fijamos en el conjunto de
glicanos en los glicolípidos y glicoproteínas de la superficie celular,
nos daremos cuenta de que la naturaleza de esa colección ha cambiado
mientras que la célula ha pasado por un proceso de diferenciación.
Desde la perspectiva de la medicina clínica,
es interesante observar que el glicoma cambia cuando las células sanas
se transforman y se convierten en células cancerosas.
Entonces se puede entender si los azúcares de la superficie celular
están cambiando de una manera que es característica de un estado canceroso;
sería muy conveniente si pudiéramos ver
esos azúcares cambiar in vivo, en seres humanos vivos.
Porque eso nos daría la posibilidad de visualizar esos cambios
y detectar cánceres cuando se encuentran, ojalá, en etapas muy tempranas.
Por lo tanto, hay muchas razones para visualizar el glicoma,
para ver cómo los azúcares están cambiando dentro de sujetos vivos.
Así podemos entender cómo están relacionados los glicanos con la diferenciación de las células
o con la organogénesis. Y podemos detectar cambios en el glicoma
que se correlacionan con los estados de enfermedad.
Así que podemos detectar estas enfermedades en etapas muy tempranas.
El desafío, por supuesto, es encontrar la manera de etiquetar estas moléculas de azúcar con
sondas que realmente podamos visualizar utilizando imagenología.
Así que incluso en el laboratorio de investigación esto es muy difícil.
La imagen más comúnmente utilizada en los laboratorios de investigación técnica
es la imagenología fluorescente u óptica.
Y ni siquiera tenemos una manera de poner etiquetas fluorescentes
en estos azúcares. Así que es un reto
que los estudiantes y becarios postdoctorales
en mi laboratorio han asumido.
Y es un proyecto que empezamos a finales de los años 90.
Así que ha ido progresando desde hace más de diez años.
Para darles un poco de contrapunto,
los que estudian las proteínas mediante la imagenología molecular
tienen un maravilloso arsenal de herramientas a su disposición,
y por eso las imágenes como la que mostré en la diapositiva anterior
son tan comunes y tan conocidas
entre la mayoría de los biólogos celulares. De hecho,
la mayoría de los biólogos celulares probablemente pasan una buena parte de su día
mirando imágenes similares a ésta.
En esta célula dos proteínas diferentes se han etiquetado
con dos colorantes fluorescentes diferentes,
uno verde y uno rojo.
La proteína que parece verde ha sido etiquetada con un mensajero genéticamente codificado.
Así que déjenme mostrarles cuál es este mensajero.
Se llama la proteína fluorescente verde, GFP (green fluorescent protein),
y es una de las herramientas más importantes para la obtención de imágenes de fluorescencia
de proteínas. La proteína fluorescente verde es una proteína que está codificada por un gen,
y resulta que se puede fusionar el gen que codifica GFP
con el gen que codifica la proteína que uno quiere visualizar.
Y ahora, cuando la fusión de la proteína GFP se expresa,
básicamente la proteína de interés es marcada con una molécula fluorescente.
La GFP tiene un cromóforo adentro que es fluorescente.
Esta es una herramienta muy importante. Ha revolucionado nuestra capacidad
de estudiar las proteínas, no sólo en células vivas, sino incluso en los organismos transgénicos.
Expresamos estas fusiones GFP mediante la manipulación del genoma
en la etapa de la célula madre embrionaria.
Esto es tan importante que fue reconocido con el Premio Nobel de Química
en el año 2008, y el premio fue concedido a estos tres científicos.
Fue uy bien merecido. Fue un desarrollo muy emocionante
en el campo de la imagen molecular.
Ahora, a aquellos de nosotros que estudian glicobiología, por supuesto,
nos encantaría que si tuviéramos una herramienta comparable
a la proteína fluorescente verde.
Podríamos etiquetar nuestros azúcares con una etiqueta fluorescente,
como la gente etiqueta las proteínas con esta etiqueta fluorescente.
Pero por desgracia, la maquinaria biosintética
por la cual los azúcares se construyen en realidad no se presta
a estos mensajeros genéticamente codificados.
Eso es porque los azúcares, a diferencia de las proteínas, no son productos primarios de genes.
Ninguno de estos glicanos complejos está codificado por un único gen.
Más bien son los productos de una serie compleja de
pasos metabólicos dentro de la célula.
Son productos del metabolismo.
Y por esa razón, no podemos utilizar los mensajeros genéticamente codificados como GFP
para introducir etiquetas en azúcares.
Así que hice este dibujo animado como una especie de comedia, porque nos encantaría
poder poner una etiqueta como GFP en los azúcares,
pero en realidad no hay mecanismo para hacer eso usando la genética.
Así que en mi laboratorio nos hemos centrado
en el uso de las vías metabólicas de la célula
para introducir sondas fluorescentes en los azúcares
que no son la GFP sino más bien pequeñas moléculas fluorescentes y mensajeras.
Les voy a enseñar esquemáticamente cómo vamos a hacer esto.
Es un proceso de dos pasos, y esto se llama marcaje metabólico de glicanos
con mensajeros químicos.
El primer paso es alimentar las células con un bloque
monosacárido sintético.
Ahora, este azúcar sintético se parece mucho a uno de los
bloques naturales de monosacáridos que se pueden encontrar
en los alimentos, e introduje esas estructuras en mi primera conferencia.
Pero la diferencia es que hemos alterado la estructura
del presente bloque de monosacáridos para introducir
un grupo químico funcional X:
X es genérico, por ahora,
y en un momento hablaremos de lo que es.
Sin embargo, X es lo que llamamos el mensajero químico.
Es un grupo funcional reactivo
de modo que cuando la célula absorbe este bloque de monosacáridos
y las enzimas lo procesan y lo integran a los glicanos,
cuando el glicano aparece en la superficie de la célula, ese grupo funcional reactivo
está ahora exhibido y se puede utilizar en un segundo paso,
que es una reacción química con una molécula de sonda.
Ahora, la sonda es un colorante fluorescente, por ejemplo.
Esa sonda tiene su propio grupo químico funcional y vamos a llamarlo Y,
como una etiqueta genérica. Sin embargo, X e Y tienen que ser diseñados
para que interactúen y se unan.
Y una vez que ese vínculo se forma,
hay una molécula de sonda fluorescente
unida a un glicano en la superficie de la célula.
Esa sonda nos permite visualizar todos los glicanos
que poseen este bloque rojo de monosacáridos
como uno de sus componentes.
Por lo tanto, éste es un esquema muy sencillo
en que lo que tenemos que hacer es alimentar la célula con un azúcar modificado
y luego realizar una reacción química en ese azúcar
una vez que se haya exhibido en la superficie celular con una sonda.
Sin embargo, resultó que había un desafío químico muy importante
escondido en este problema porque hay que seleccionar
el mensajero químico X y un grupo funcional complementario Y,
de modo que estos dos grupos funcionales reaccionen
sólo entre sí y con ninguna otra cosa dentro de esta célula.
Hay una gran cantidad de funcionalidad al interior de la célula.
Proteínas, lípidos, ácidos nucleicos,
metabolitos, agua... hay una gran cantidad de entidades químicas al interior de la célula
y X e Y tienen que ser diseñados para evitar cualquier reacción secundaria
con los grupos biológicos y reaccionar sólo uno con otro.
Así que ése fue un reto muy importante
y nombramos el concepto de ese reto
con el término "bioortogonal".
Por lo tanto, lo que esto significa literalmente es "no interactuar con la biología".
X e Y tienen que reaccionar mutuamente y de forma selectiva entre sí.
No pueden reaccionar con ninguna cosa
que se encuentre en la naturaleza. Y sin duda no pueden ser dañinos
para el sistema biológico que se estudia;
de lo contrario sería un desastre desde el punto de vista de
visualizar azúcares en animales vivos.
Así que pasamos muchos años tratando de elaborar reacciones que
básicamente se ajustan a esta descripción donde los dos
homólogos reactivos, X e Y, son bioortogonales.
Para resumir, lo que hemos descubierto es que
un mensajero químico ideal, o sea el grupo X que ponemos dentro del azúcar,
es la azida, que por definición tiene
tres átomos de nitrógeno unidos entre sí
de una manera que se muestra aquí.
Ahora, la azida tiene una serie de propiedades que la hacen muy adecuada
para esta aplicación particular como un mensajero químico.
Primero y ante todo, las azidas no se encuentran en los sistemas biológicos.
Por lo que sabemos, los químicos inventaron la azida.
No la hemos encontrado en la naturaleza.
Tal vez la naturaleza ignoró este grupo funcional
cuando creó toda la diversidad química
que existe en nuestro planeta.
Además, las azidas son esencialmente inertes en los sistemas biológicos.
Realmente no hay mucho con que pueden reaccionar
entre lo que normalmente se encuentra en un entorno biológico.
Las azidas son muy fáciles de ensamblar en moléculas de azúcar.
La química es muy simple.
Y lo más importante, las azidas son pequeñas.
Así que el radio de van der Waal de una azida es de sólo 2,4 Angstroms.
Lo que significa que es un poco más grande que un grupo de metilo.
Y eso es importante porque estamos adjuntando una azida a un azúcar
y pidiendo a de todas las enzimas
de la célula metabolizar ese azúcar como si
se tratara de un sustrato metabólico normal.
Así que no podemos cambiar la estructura demasiado;
de lo contrario las enzimas podrían rechazar
ese azúcar por ser demasiado extraño, demasiado artificial.
Pero la azida es una modificación muy pequeña.
Pensamos que tal vez podríamos colarla por la puerta.
de algunas de esas enzimas.
Permítanme hacer una observación porque
me hacen esta pregunta con frecuencia
entre los biólogos. Muchos biólogos están familiarizados con la palabra azida
en el contexto de la azida sódica
y saben que la azida de sodio es un veneno metabólico.
A menudo ponen un poco de azida de sodio en sus zonas de amortiguamiento
para evitar el crecimiento bacteriano. Así que saben que la azida de sodio es citotóxica.
Por eso, me preguntan: "¿No son citotóxicas las azidas?
¿Cómo se puede poner una azida en un azúcar
y alimentar las células y los organismos? ¿No es tóxico?"
La respuesta es no. La azida sódica es una entidad muy diferente
de las azidas unidas a una molécula.
Una vez que la azida se une a una molécula como un azúcar,
es totalmente inocua. Por el contrario, si es una sal de azida, como azida de sodio,
es verdad: entonces es muy tóxica.
Pero en realidad no tenemos que preocuparnos por eso
porque no hay forma en que el cuerpo pueda convertir una azida de azúcar
a algo como una azida de sodio.
Así que no se preocupen por eso.
Bien. Ahora lo más importante de la azida
es que puede experimentar
reacciones químicas con otros grupos funcionales.
Recuerden que en la diapositiva anterior los llamé Y.
El otro grupo es Y. Este grupo es X.
Hay varios grupos Y que reaccionan con azidas.
Y el primer grupo semejante que hemos explorado
es la fosfina. Es lo que se obtiene cuando tomamos un átomo de fósforo
y lo unimos a tres sustituyentes, lo cual muestro aquí.
Ahora, en la primera parte del siglo 20,
estamos hablando de alrededor de 1915-1920,
un químico alemán llamado Hermann Staudinger
descubrió que las fosfinas reaccionarán con azidas para generar
un producto en el que hay un unión de fósforo-nitrógeno,
y llamó este tipo de producto intermedio un aza-ylide.
Es una reacción muy interesante en que estos
dos grupos químicos se unen y hacen este aducto covalente
Estábamos intrigados por esta química de Staudinger
porque tanto la fosfina y como la azida son bioortogonales
y su reacción es muy selectiva. No son tóxicas.
Y parecían cumplir muchos de estos criterios para ser bioortogonales,
con una excepción: resulta que los aza-ylides
no son particularmente estables en agua.
Tienden a hidrolizarse.
Así que la unión P-N se escinde.
Por supuesto, si nuestro objetivo es utilizar la química
para unir una sonda a un azúcar en el cuerpo vivo
donde estamos rodeados de agua,
entonces esa sensibilidad hidrolítica sería un gran problema para un aza-ylide.
Así que lo que hicimos fue modificar esta reacción de una manera bastante sutil:
unimos al átomo de fósforo un anillo de benceno
que tenía este grupo de metoxicarbonilo.
Así que una vez que el aza-ylide se formó
más rápido de lo que podría hidrolizar, este átomo de nitrógeno
se cicló a este carbonilo, escindió el vínculo éster
y formó una amida.
Esta ciclación fue tan rápida que
ni siquiera importó si había agua alrededor.
Ahora, una vez que este producto se formó,
el agua podría venir en cualquier momento:
hidrolizó la unión P-N y formó este producto, pero ahora, como una unión de amida
se produjo durante esta etapa de ciclación intramolecular,
estas dos partes, una que viene de la azida
y la otra unida a la fosfina,
todavía estaban unidas entre sí a través de una unión muy estable.
Así que esto es lo que llamamos la unión de Staudinger.
Es una reacción en la que aprovechamos de la química clásica de Staudinger
en el primer paso, pero luego la alteramos para formar un producto
en el que los dos componentes están permanentemente
unidos entre sí de una manera que es
muy estable en un sistema biológico.
La unión de Staudinger fue una de los primeras
reacciones químicas que utilizamos para tratar de visualizar a los azúcares en los sistemas vivos.
Entonces ¿cuáles azúcares quieren visualizar?
Por supuesto que hay muchas opciones interesantes.
Y como ya describí en mi primera conferencia,
en los vertebrados hay nueve
bloques fundamentales de monosacáridos
que son los constituyentes de nuestros glicanos diferentes.
Todos son interesantes por derecho propio,
pero cuando estábamos pensando en cuál azúcar nos gustaría visualizar,
nos atrajo naturalmente este monosacárido,
llamado ácido siálico. Como ya he mencionado en mi primera conferencia,
el ácido siálico tiende a aparecer en algunas circunstancias muy interesantes
en los sistemas biológicos vertebrados.
He mencionado, por ejemplo, que el ácido siálico
es un componente del ligando para las selectinas.
También mencioné que el ácido siálico
es la estructura a la cual se une el virus de la gripe.
Bueno, resulta que el ácido siálico es un monosacárido bastante ocupado
porque también parece estar relacionado con el desarrollo embrionario
y el cáncer. De hecho, los glicomas de células embrionarias,
tejidos diferenciados y células de cáncer
se han estudiado en mucho detalle,
y resulta que muchos de los glicanos
que se encuentran tanto en los embriones como en los cánceres
tienen ácido siálico como uno de sus componentes.
Así que lo que he mostrado aquí son sólo tres ejemplos de un conjunto mucho más amplio.
Se trata de estructuras de glicano que son altamente frecuentes
en los cánceres en comparación con el tejido sano normal.
Y muchas de ellas están también reguladas por el desarrollo,
lo cual probablemente no es un accidente, porque sabemos que muchas veces los cánceres
comienzan a adquirir propiedades que
normalmente asociamos con el tejido embrionario.
En cierto sentido, han perdido su identidad
y están volviendo a un estado embrionario,
y eso se refleja en sus estructuras de glicanos.
El ácido polisiálico, que es un ***-polímero
compuesto de unidades de repetición de ácido siálico,
es muy abundante en una variedad de tumores
que se derivan de la cresta neural.
Sialil Lewis X, que mencioné antes,
es parte del ligando para las selectinas
y también se encuentra en niveles elevados en una variedad de cánceres epiteliales
y cánceres de la sangre. Y Sialil Tn, un disacárido muy simple,
en realidad no se encuentra normalmente en cualquier tejido humano sano,
pero aparece en una variedad de cánceres de próstata.
No se sabe muy bien por qué,
pero el hecho de que estas estructuras aparezcan en el contexto de las neoplasias malignas
ha sugerido a muchas personas que podría haber
niveles elevados de ácido siálico en estos tejidos.
Así que si pudiéramos visualizar los ácidos siálicos,
tal vez podríamos detectar estos tumores en los sistemas vivos.
Esa fue una de las motivaciones para el estudio de los ácidos siálicos.
Bien. Entonces la pregunta llegó a ser, en nuestras mentes, la siguiente:
¿cómo podemos poner una azida en los ácidos siálicos?
Bueno, tenemos que entender el metabolismo fundamental
que produce el ácido siálico en nuestro cuerpo.
Y eso es lo que se muestra en esta diapositiva.
Todo comienza con este bloque simple de monosacáridos
llamado N-acetilmanosamina
y abreviado ManNAc.
Nosotros comemos el ManNAc y de hecho, si comemos el pan o tomamos cerveza,
cualquier producto de levadura tendrá algún ManNAc.
Si Uds. no comen ManNAc, está bien
porque pueden biosintetizarlo de la glucosa
a través de otros pasos enzimáticos que no he mostrado.
Pero, en cualquier caso, una vez que ManNAc entra en el sistema,
tiene básicamente un solo destino metabólico.
Está destinada a convertirse en ácido siálico
en las células. Y eso pasa por una serie de pasos enzimáticos
y no voy a explicar todos esos detalles.
Por supuesto, pueden ver la diapositiva en detalle si están interesados.
Pero basta con decir que comemos este azúcar
y después de que todas estas enzimas hayan actuado sobre él,
al final del día se hace un ácido siálico,
y aparece por lo general en el extremo de la cadena de glicano complejo
sobre la superficie de la célula, ya sea en un glicoproteínas o glicolípidos.
Así que sabíamos del trabajo de muchos laboratorios
que este azúcar se convierte en ése.
Y he mostrado el grupo acetilo en azul.
Así que está claro que donde termina eso en el producto biosintético.
La razón por la que pongo de relieve ese grupo acetilo
es porque sabemos del trabajo de varios grupos
que se pueden hacer modificaciones sutiles
a la estructura en esta posición sin
dañar significativamente la eficiencia de
cualquiera de estos pasos enzimáticos,
lo cual en realidad es bastante notable si lo pensamos.
Normalmente pensamos que las enzimas son muy especiales
por sus sustratos, pero en esta vía
hay un poco de flexibilidad y
se puede modificar esta cadena lateral un poco.
Así que sabiendo eso, era claro que se trataba de un sitio
donde podríamos unir una azida
sin confundir las enzimas en la célula.
Y eso es exactamente lo que hicimos.
Así que por síntesis química, generamos esta versión no natural
de ManNAc, que tiene una azida.
Como una abreviatura, llamamos este compuesto ManNAz,
que es la versión azida de ManNAc.
Queríamos conseguir ManNAz en las células y para hacer eso
bloqueamos cada uno de los grupos de hidroxilo, que son característicos de moléculas de azúcar
con ésteres de acetilo. Esos son grupos protectores.
Una vez que los grupos de acetilo están en el lugar correcto,el azúcar es ahora lo suficientemente lipofílico
para penetrar la membrana celular, y una vez que está dentro de la célula,
tenemos esterasas no específicas que simplemente escinden
estos grupos de acetilo los desechan.
Luego el azúcar está listo para el metabolismo.
Así que las enzimas empiezan a procesar el azúcar
y después de varias horas, lo que descubrimos es que
una fracción de los residuos de ácido siálico
en estas células han sido reemplazados con un análogo azido.
Es decir, todo lo que hacemos es añadir este compuesto a los medios de cultivo
y las células hacen todo el trabajo duro
y producen este ácido azido-siálico en sus glicanos de la superficie celular.
Sorprendentemente las células no parecen especialmente
dañadas por esta transformación.
Alguna fracción de sus ácidos siálicos
han sido reemplazados con esta variante no natural,
y eso no parece molestarlas.
Pero es muy conveniente para nosotros
porque ahora podemos utilizar la azida para hacer química.
Al introducir un reactivo de fosfina
que se ha vinculado con una sonda fluorescente,
hacemos una ligadura de Staudinger entre la fosfina y la azida.
Ahora hay una unión covalente entre la molécula de sonda y el azúcar.
Así que dondequiera que haya un ácido siálico,
ahora podemos visualizarlo
usando microscopía de fluorescencia enfocada en la sonda.
De esta manera hemos podido visualizar
ácidos siálicos sobre varios tipos celulares interesantes.
Y el ácido siálico no es el único azúcar
que se puede ver utilizando la azida como un mensajero químico.
Por lo tanto, al igual que podemos introducir la azida en ácido siálico
al alimentar las células con ManNAz,
resulta que podemos introducir una azida en fucosa
simplemente al alimentar las células con este derivado 6-azido fucosa,
que tiene ésteres de acetilo protegiendo sus grupos de hidroxi.
Del mismo modo, podemos introducir azidas en N-acetilgalactosamina
o GalNAc, alimentando las células con esta forma modificada de GalNAc,
que tiene una azida en su grupo de acetilo. A esto le llamamos GalNAz.
Es análogo a Mannaz y en realidad voy a volver a este azúcar,
GalNAz, hacia el final de la conferencia.
También invertimos mucho tiempo en desarrollar sondas
que se pueden utilizar para visualizar estos azúcares.
Ahora, la ligadura de Staudinger es maravillosamente selectiva
porque nos permite formar una unión covalente entre la sonda y el azúcar.
Pero más que eso, podemos aprovechar los elementos
de esa química de ligación para diseñar lo que llamamos sondas inteligentes.
Estas son las sondas que son realmente invisibles
hasta que encuentren un azúcar azido
al que se unen por la ligadura de Staudinger,
y entonces se vuelven fluorescentes.
Así que básicamente nadan en el sistema
buscando azidas y tan pronto como las encuentran,
se unen a ellas y producen luz-- no se ven de otra manera.
Esto nos permite hacer imágenes de fluorescencia
con muy buena señal por encima del fondo.
La forma de hacerlo es aprovechar el hecho de que
durante la ligadura de Staudinger
esta unión de éster se escinda.
En las diapositivas anteriores tenía simplemente un éster metílico en esta posición,
donde el metanol se libera durante la reacción,
lo que no es particularmente notable.
Pero se podría sustituir ese éster metílico
con una unión entre éster y un bloqueador de fluorescencia.
Y si hay una molécula fluorescente unida en otro lugar,
ese fluoróforo se inactivará
por el inhibidor de fluorescencia en esta molécula inicial.
Pero tan pronto como esta sonda encuentra una azida,
situada dentro de un ácido siálico, digamos, u otro azúcar en la célula,
la fosfina reacciona con la azida,
la ligadura de Staudinger se deshace,
el éster se escinde, el inhibidor se libera
y ahora ese fluoróforo se activa.
Así que sólo cuando el fluoróforo encuentra su objetivo
y reacciona, sólo entonces se ve la fluorescencia.
De lo contrario es invisible.
Les voy a enseñar la estructura química de una sonda
que preparamos y que sigue precisamente este mecanismo.
Esta es una molécula que llamamos cariñosamente QPhos,
que significa fosfina bloqueada ("quenched phosphine").
Tiene tres partes:
esta zona verde es una molécula fluorescente
muy bien conocida y llamada fluoresceína.
Es un colorante fluorescente verde de uso común en el laboratorio de investigación.
En la mitad en *** hay una fosfina que está toda lista para una ligadura de Staudinger.
Se puede ver que en este anillo de benceno no hay un grupo éster.
Está posicionado para esa reacción intramolecular
del intermedio aza-ylide.
Y finalmente aquí, la parte azul
es un extintor de fluorescencia muy conocido,
llamado Dispersador Rojo 1 (Disperse Red 1).
Siempre y cuando este Dispersador Rojo 1 está vinculado a este éster,
se apagará la fluorescencia de la molécula de fluoresceína.
Así que permítanme mostrarles algunas imágenes que tomamos con QPhos
para detectar ácido siálico en células cancerosas en cultivo.
En este experimento lo que hicimos fue cultivar unas células
llamadas células HeLa. Estas son células humanas epiteliales de cáncer de cuello uterino
que pueden cultivarse en un tubo de ensayo. Mientras que las células estaban cultivándose,
las alimentamos con ManNAz en los medios.
Simplemente lo añadimos a los medios de cultivo,
las células lo tomaron, lo digirieron y pusieron azidas en sus ácidos siálicos.
Luego, después de unos días de tratamiento con ManNAz,
reaccionamos esas células con QPhos.
Después de un par de horas, tomamos una imagen fluorescente de las células.
Las células también se tiñeron con un tinte fluorescente azul
que es específico para el núcleo.
Eso ayuda a saber exactamente dónde se ubican las células
ya que cada una tiene un núcleo.
Por lo tanto, lo que podemos ver es que cada célula
está rodeada por un bonito contorno verde brillante.
Esos son los ácidos siálicos en
las glicoproteínas y los glicolípidos asociados a la membrana
de la célula y que están muy bien iluminados.
Estamos en realidad visualizando los azúcares.
Es posible que vean un poco de fluorescencia al interior de las células también.
Eso es básicamente parte de la vía secretora,
el compartimento de Golgi, por ejemplo.
Y luego hay un poco de tinción de
pequeñas vesículas en todas las células.
Eso es porque cuando reaccionamos ácidos siálicos en la membrana,
algunos de esos ácidos siálicos terminan internalizándose
en vesículas porque las membranas están siendo constantemente
absorbidas, recicladas y dadas vuelta.
Están yendo a la parte trasera del compartimento de Golgi
y luego regresan a la membrana.
Hay mucho que hacer, de hecho, durante el curso de la reacción con QPhos.
Ahora, tuvimos algunos problemas cuando empezamos a
hacer este tipo de experimentos.
Por ejemplo, nos dimos cuenta de que para obtener esta tinción brillante
de los ácidos siálicos, tuvimos que reaccionar las células con QPhos durante varias horas.
Ahora, eso no es un problema para visualizsar los azúcares en las células cultivadas,
porque las células están en un matraz con los reactivos
y pueden estar en la incubadora durante varias horas,
dejando que la reacción se desarrolle.
La razón por la que tuvimos que dejar que la reacción durara varias horas
en lugar de varios minutos
o varios segundos es porque resulta que la reacción de ligadura de Staudinger
es intrínsecamente bastante lenta. Ese es simplemente el tiempo que requiere la reacción.
Y a pesar de que no era demasiado problemático
para experimentos de imagenología en células cultivadas,
nos preocupaba que eso fuera un problema
para visualizar azúcares en animales vivos,
porque, por supuesto, un animal vivo no está en equilibrio.
No son células en un matraz, esperando en una incubadora durante muchas horas.
Los animales tienen un metabolismo activo.
Tan pronto como se introducen en ellos los reactivos,
sus cuerpos se ponen a trabajar para sacar esos reactivos.
Y ese proceso de limpieza puede ser muy rápido para ciertas moléculas
y ciertos animales. De hecho, cuando empezamos a pensar en la ligadura de Staudinger
como una herramienta para visualizar azúcares en ratones de laboratorio,
de inmediato nos encontramos con este problema.
Así que inyectamos a los ratones con ManNAz
y descrubrimos que en el animal
las células estaban perfectamente dispuestas a aceptar este azúcar
y convertirlo en el ácido azido-siálico,
que no era problema.
Y parecía inocuo para los ratones.
Así que al parece no había impedimento para reemplazar
una fracción de los ácidos siálicos con la versión azido.
El problema vino cuando luego inyectamos esos mismos ratones
con las moléculas de sonda unidas a una
fosfina para la ligadura de Staudinger.
Porque lo que hemos descubierto es que la
reacción entre la fosfina y azida
fue demasiado lenta en comparación con la tasa del despejamiento metabólico
de la sonda en el cuerpo animal.
Así que sólo podíamos detectar un poco de este producto
en determinados órganos y tejidos,
en los órganos y tejidos más accesibles
a los reactivos después de que los inyectamos
o los órganos y tejidos que tenían niveles muy, muy altos
del ácido siálico que estábamos tratando de visualizar.
Y eso fue un poco frustrante,
pero básicamente señaló un elemento muy importante
de este experimento, que en realidad no habíamos considerado al principio,
hace diez años.
Es que la cinética de la reacción
entre la azida y la molécula de sonda
es muy, muy importante para la imagenología en animales vivos.
Esa reacción tiene que ser lo suficientemente rápida
de modo que la sonda pueda encontrar la azida y reaccionar
más rápidamente de lo que se despeja del cuerpo.
Después de muchos años de experimentación,
finalmente llegamos a la conclusión de que la ligadura de Staudinger era demasiado lenta.
Sus cinética era demasiado lenta en comparación con su tasa de metabolismo.
Y probablemente no ayudó el hecho de que las fosfinas, en general,
puedan ser oxidadas en el hígado de los mamíferos
por las enzimas del citocromo P450,
que convierten la fosfina en un óxido de fosfina,
y una vez que eso ocurre, este producto
ya no está activo en una ligadura de Staudinger.
Así que, sin duda, el metabolismo de fosfina en el hígado
contribuyó a su rápida tasa de limpieza,
lo cual derrotó la cinética intrínsecamente lenta de la reacción.
Así que el tema es que la ligadura de Staudinger
era estupenda para la imagenología in vitro de células en cultivo,
pero no tan buena para la imagenología in vivo de organismos vivos,
que tienen la capacidad de eliminar los reactivos rápidamente del sistema.
Así que en ese punto se desplaza nuestra atención
a otro tipo de química que las azidas pueden experimentar.
Es otra química que tiene sus orígenes en el siglo pasado
en las manos de un químico alemán:
Rolf Huisgen, Profesor de la Universidad de Munich,
quien en la década de 1950 descubrió que las azidas
pueden reaccionar con los alquinos, experimentando una reacción 1,3-dipolar
de cicloadición, cuyo mecanismo se muestra aquí,
para formar un producto de aducto de ciclo llamado un triazol.
Ahora, como la química de Staudinger,
esta química de cicloadición de Huisgen
es bioortogonal porque los alquinos y las azidas
no se encuentran en los sistemas biológicos,
al menos no en la mayoría de los sistemas biológicos
y reaccionan unos con otros muy selectivamente
sin reacciones secundarias no deseadas en el sistema vivo.
Así que pensamos que ésta sería otra vía para explorar.
El problema es que la reacción clásica de Huisgen,
según se describe con un alquino estándar y lineal,
también es muy lenta. De hecho, incluso más lenta
que la química de Staudinger con fosfinas.
Tan lenta, que cuando la gente realiza
estas reacciones en un laboratorio de investigación,
por lo general tienen que aplicar temperaturas
o presiones elevadas para que la reacción
proceda a terminar a una velocidad razonable.
Y cuando digo temperaturas elevadas,
quiero decir por encima de 100° C, por ejemplo.
Así tolueno a reflujo. Más caliente que la temperatura del agua hervida.
Obviamente, no podemos hacer eso a las células
y ciertamente no a los organismos vivos.
Pero empezamos a pensar en maneras de
acelerar la velocidad de esta química.
Resulta que en los años 60
había una publicación de Wittig y Krebs
en la que se informó de que phenylazide reacciona con
cyclooctyne, que tiene una unión triple en un anillo de ocho miembros
para formar el producto triazol muy rápidamente.
Mis estudiantes de posgrado leyeron este artículo.
Fue publicado en alemán,
y lamentablemente en ese momento no teníamos
compañeros en el laboratorio que hablarn el alemán tan bien como
para realmente entender el paper en su detalle.
Pero todos leímos esta frase
y reconocimos 3 palabras: phenylazide, cyclooctyne y explosión.
Según entendimos, Wittig y Krebs
habían combinado estos dos reactivos
y formaron un producto como una explosión,
lo que nos sugirió que ésta debe ser una reacción bastante rápido.
Tengan en cuenta, sin embargo, que lo que hicieron Wittig y Krebs
fue reaccionar el cyclooctyne ordenado,
que es un líquido, con phenylazide ordenado y sin disolvente.
Así que éstos fueron reactivos muy concentrados que reaccionaron como una explosión.
Y pensamos, si disolvemos estos reactivos en concentraciones más bajas
y disolventes prototípicos, tal vez la reacción
sea muy bien controlada
y ojalá aún muy rápida a temperatura ambiente.
Ahora, Uds. podrían preguntarse por qué reacciona cyclooctyne
con una azida de modo explosivo mientras que
los alquinos lineales son tan lentos que hay que
calentarlos por encima de 100°?
Esto se puede entender al ver lo que sucede
a un alquino cuando lo empujan adentro de a un anillo de ocho miembros.
Ahora, normalmente los alquinos son lineales.
Esa es su geometría preferida.
Y cuando un alquino reacciona con una azida, el ángulo de esta unión
va desde 180° a 120° en el producto triazol.
Así que la deformación de esa unión gasta mucha energía
en el estado de transición de la reacción.
Es por eso que tenemos que calentarla,
para proporcionar esa energía y superar esa barrera de activación.
Por el contrario, si el alquino está incrustado en un anillo de ocho miembros,
ahora el ángulo de la unión se dobla a 160°.
No es lo ideal, de hecho es un montón de presión
doblar una unión triple a 160°.
Pero el resultado es que ahora la diferencia
entre 160° y 120° es un poco más pequeña.
No cuesta tanta energía ir
de esta estructura a través de un estado de transición
para llegar a este producto.
Así que nuestra esperanza era que al forzar el material inicial
y doblar el ángulo de la unión para que estuviera más cerca
a la estructura del estado de transición,
bajaríamos la barrera de activación
de modo que la reacción pudiera transcurrir a temperatura ambiente.
Y eso es exactamente lo que observamos cuando sintetizamos químicamente
toda una familia de cyclooctynes en el laboratorio.
Permítanme resumir rápidamente algunas comparaciones cinéticas
que realizamos usando una variedad de reactivos sintéticos.
Cada uno de estos compuestos es un cyclooctyne,
en algunos casos con un heteroátomo en el anillo
con diversos sustituyentes en diferentes sitios,
e hicimos estos compuestos por varias razones
en que no voy a entrar.
Pero verán que en algunos casos había carbonos sp2 híbridados
en otras partes del anillo. Nuestra esperanza era poder aumentar la energía de tensión
un poco más al colocar
allí carbonos sp2 hibridados.
Y algunos de estos reactivos
tienen sustituyentes electronegativos de flúor,
que también pensamos que podrían acelerar la reacción
a base de algunas argumentos sobre moléculas orbitales fronterizos.
También se muestra entre esta colección un reactivo de fosfina
que está configurado para una ligadura de Staudinger.
Lo que hicimos fue tomar cada uno de estos compuestos.
Reaccionamos cada compuesto con una azida de bencilo
en un tubo de ensayo. Luego se midió la
velocidad del constante de segundo orden de la reacción.
En azul se muestran básicamente los valores relativos que medimos.
En resumen, encontramos un compuesto
que reacciona muy rápidamente con azidas en un tubo de ensayo.
Este es un cyclooctyne di-fluorado
al que hemos dado la abreviatura DIFO.
Así que eso significa Di-Fluoro Cyclo Octyne.
DIFO. Y la tasa relativa de reacción de DIFO
en comparación con algunos otros compuestos que verán,
por ejemplo un compuesto sin los átomos de flúor.
es muy alta. Así que podemos acelerar el ritmo 75 veces
sólo al poner algunos átomos de flúor aquí
en comparación con algunos compuestos originales.
Es importante destacar que, si se compara la tasa relativa de reactividad
entre DIFO y una fosfina de la ligadura de Staudinger,
verán que es 15 veces más rápida.
Así que pensamos que donde la ligadura de Staudinger
fracasa in vivo debido a su cinética lenta,
podríamos encontrar el éxito ahora con DIFO
como contrapartida a la azida reactiva.
Probamos ese concepto en una variedad de experimentos imagenoloógicos,
comenzando simplemente con cultivos de células HeLa.
Recuerden que en una diapositiva anterior mostré
algunas imágenes de los ácidos siálicos en células HeLa
en las que reaccionaron las azidas con QPhos.
El experimento de ahora es muy similar, pero
cuando pusimos las azidas en los ácidos siálicos,
esta vez las azidas reaccionaronn con este compuesto.
Lo llamamos DIFO-488.
Aquí abajo está la parte DIFO, el cyclooctyne di-fluoro.
La parte verde de la molécula es un colorante
fluorescente comercial llamado Alexafluor 488.
Es un poco como la fluoresceína en sus propiedades espectrales.
Por eso lo llamamos DIFO-488.
Así que lo que estamos viendo aquí son los cultivos de células HeLa.
Han sido alimentadas con ManNAz para poner azidas en los ácidos siálicos.
Entonces se les hace reaccionar con DIFO-488
y se puede ver que los ácidos siálicos se muestran en estos
brillantes halos verdes alrededor de cada célula.
Las membranas están muy bien iluminadas.
Esos son los ácidos siálicos.
Este es un experimento de control
en el que en lugar de alimentar con ManNAz a las células
les dimos el azúcar natural, ManNAc.
No hay azidas en estas células.
También les himos reaccionar con DIFO-488.
Y ahora no se ve ninguna etiqueta verde de las membranas.
Esto es porque no hay azidas con las que DIFO pueda reaccionar.
Eso es un testimonio de la selectividad de DIFO.
Sólo reacciona con azidas.
Si no hay azidas alrededor, no hay nada con que reaccione.
No se ven los azúcares.
Pero el número más importante en esta diapositiva
es éste de aquí.
Podemos ver una imagen hermosa como ésta
al reaccionar las células durante menos de 1 minuto con DIFO-488.
Mientras que en el experimento anterior con QPhos,
el reactivo de unión de Staudinger,
tuvimos que reaccionar las células durante más de dos horas.
Si podemos conseguir este tipo de imagen dentro de un minuto,
creo que podemos visualizar los azúcares en animales vivos.
Esta reacción es lo suficientemente rápida, según esperábamos.
Entonces, ¿cuál modelo animal sería bueno utilizar para la imagenología de los azúcares?
Los ratones son, obviamente, un modelo muy atractivo porque se puede
estudiar una variedad de enfermedades humanas en ese organismo modelo,
incluyendo el cáncer. Sin embargo, los ratones no son ideales para la imagenología óptica
porque, como Uds. saben, no son transparentes.
Ellos son opacos.
Uno puede hacer imágenes de fluorescencia al interior de un ratón,
pero eso requiere un tipo específico de colorante, generalmente uno infrarrojo,
y es un experimento más complicado.
En nuestro primer intento de imagenología óptica in vivo,
pensamos que podríamos utilizar un organismo modelo
que es un poco más amigable con un microscopio óptico.
La elección obvia era el pez cebra.
Esos peces son transparentes.
Se puede ver a través de ellos
y observar sus órganos en vivo,
en el animal vivo. También, el pez cebra
es un modelo muy atractivo para los estudios del desarrollo de vertebrados.
Ellos tienen todos los mismos órganos y partes que tenemos nosotros.
Son vertebrados. Y su programa
de desarrollo embrionario ha sido muy bien caracterizado.
Así que sabemos cómo deben ser
los embriones de pez cebra en casi todas las etapas de su desarrollo.
También sabemos que hay cambios en el glicoma,
que corresponden al desarrollo embrionario.
Así que pensamos que éste era un organismo muy bueno
primero para probar nuestras herramientas químicas
y segundo porque podríamos abordar
algunas preguntas fundamentales muy interesantes
sobre cómo cambia el glicoma durante el desarrollo,
y aprender algo sobre el campo de glicobiología.
Por lo tanto, comenzamos con unos experimentos de pruebas conceptuales,
en los que no nos centramos en el ácido siálico,
sino más bien en un azúcar llamado N-acetilgalactosamina,
GalNAc para abreviar.
La razón por la que estábamos tan interesados
en GalNAc era porque, como ya dije en mi primera conferencia,
es el principal residuo conservado en una familia
de O-glicanos ligados que están asociados
a las glicoproteínas de la familia mucina.
Las mucinas son una clase general de glicoproteínas
que se caracterizan por tener grupos densos
de estos glicanos unidos a O a lo largo de la cadena principal del polipéptido.
Están implicados en la adhesión celular,
la regulación de interacciones intercelulares, y se sabe que son
a veces regulados
y a veces no regulados durante la transformación maligna.
Así que las mucinas son una clase de glicoproteínas interesante.
Todos ellos tienen un residuo de GalNAc en su posición central.
Así que pensamos que si pudiéramos introducir una azida
en este residuo de GalNAc quizás podríamos visualizar las mucinas
in vivo. Y la forma de hacerlo es
simplemente alimentar las células, o en este caso, los embriones de pez cebra,
con este derivado de azido-acetil que llamamos GalNAz.
Una vez más, los grupos hidroxi están protegidos con ésteres de acetilo.
De manera que el compuesto puede penetrar las membranas celulares
y dentro de la célula los grupos de acetilo son eliminados por las esterasas
in vivo. Bien. Así que éste fue uno de los primeros experimentos
que realizamos para simplemente preguntar, ¿metabolizarán los embriones de pez cebra
el GalNAz y lo introducirán en las mucinas?
Y si es así, ¿podemos entonces etiquetar las azidas
con reactivos Difo y visualizar ese azúcar en vivo?
Pues, en este experimento fertilizamos los embriones de pez cebra en un tubo de ensayo,
añadimos GalNAz a los medios de cultivo
y dejamos que se desarrollaran en el transcurso
de varios días; después de aproximadamente cinco días,
tomamos las larvas de pez cebra de cinco días de edad
y las hicimos reaccionar con DIFO vinculado a un tinte fluorescente,
en este caso DIFO-488,
el mismo compuesto que mostré en la diapositiva anterior.
Luego pusimos los peces cebra etiquetados en un microscopio de fluorescencia
y tomamos una foto. Así que lo que están
viendo aquí es el pez cebra etiquetado
de cinco días, tratado según se muestra
en este esquema. Dondequiera que ven un brillo,
básicamente están viendo la etiqueta de DIFO
que se ha unido covalentemente al azúcar azido.
También hay un pez cebra de cinco días de edad en este panel.
Uds. no pueden verlo, lo sé.
La razón es que la única diferencia
es que este embrión de pez cebra, desarrollado en la presencia de
GalNAc, el azúcar natural, no tiene azidas.
Así que cuando reaccionamos este pez cebra de cinco días con DIFO-488,
no había nada con que el tinte reaccionara,
por lo que no se ve ninguna fluorescencia.
Una vez más, esto demuestra la exquisita selectividad de DIFO
para la azida. Así que básicamente este experimento
nos demostró que en realidad podemos visualizar
aquellos residuos de GalNAz en un pez cebra in vivo.
Y debo señalar que estos peces cebra
parecen perfectamente normales, perfectamente saludables
y felices, a pesar de que una fracción
de sus residuos de GalNAc fueron reemplazados con GalNAz
y una fracción de esos residuos de GalNAz
se hicieron reaccionar químicamente con el reactivo DIFO.
Estos peces cebra luego fueron puestos en libertad en sus tanques,
y pasan a vivir una vida normal, según podemos ver.
Por lo tanto, no parece ser perjudicial para el organismo,
lo cual es importante si el objetivo es aprender algo
sobre la biología fundamental del organismo.
También podemos hacer experimentos
donde buscamos cambios en el glicoma
como una función del tiempo,
que a su vez es uno de los aspectos más interesantes
del campo de la glicobiología.
Por ejemplo, aquí hay un experimento en el que tomamos
un embrión de pez cebra fecundado en el cultivo
añadimos GalNAz a la cultura mediática
y dejamos que los embriones se desarrollaran en la presencia del azúcar azido.
Ahora, en un punto de tiempo dado,
tomaremos los embriones de los medios,
los enjuagaremos y los reaccionaremos
con DIFO vinculado a un colorante fluorescente rojo.
En este caso se trataba de Alexafluor 647.
Algunas glicoproteínas, las que fueron etiquetadas
con azidas, ahora aparecen de color rojo.
Pero podemos tomar esos mismos embriones
que están llevando una sonda fluorescente,
ponerlos de nuevo en los medios
y dejar que sigan en su programa de desarrollo.
Lo que hacemos primero es una reacción de 10 minutos
con un reactivo llamado TCEP,
tricarboxydiethylphosphine.
Lo que este reactivo hace es que reduce cualquier
azida no reaccionada a la amina correspondiente.
Por supuesto, la química por la cual TCEP
reduce las azidas sin reaccionar
es la clásica química de Staudinger.
Podemos aprovechar de eso.
Así que simplemente destruimos todas las azidas sin reaccionar.
Tomamos estos embriones rojos marcados,
los devolvemos a los medios que contienen GalNAz
y continúan desarrollándose.
En el proceso ocupan más GalNAz
y lo integrarán en la próxima
ola de glicoproteínas de mucina.
Ahora podemos sacar los embriones
y etiquetarlos de nuevo, esta vez con DIFO
vinculado a un colorante fluorescente verde.
Así que ahora, al final de todo esto,
hay dos colorantes fluorescentes en el pez cebra.
El tinte verde refleja estas azidas que están
en las glicoproteínas biosintetizadas más recientemente.
Mientras que el tinte rojo refleja la población de glicoproteínas
de más edad que se introdujeron antes en el desarrollo.
Así que esto nos permite separar las glicoproteínas de edad de glicoproteínas nuevas
a base del color en que aparecen en el microscopio de fluorescencia.
Ese tipo de experimento es lo que llevó a las imágenes como ésta
que mostré en la primera diapositiva de esta segunda conferencia.
Esta es la cabeza de un pez cebra de 5 días de edad
que se ha marcado con GalNAz,
seguido de tres diferentes tintes fluorescentes
en tres puntos temporales diferentes.
En esta imagen en particular las glicoproteínas más recientes
se ven rojas, y Uds. pueden ver que hay
una concentración de dos glicoproteínas
aquí en los órganos olfativos,
que son básicamente las fosas nasales del pez cebra.
Mientras que las poblaciones mayores de glicoproteínas aparecen en azul o verde.
Y se puede ver que el azul y el verde
tienen una distribución bastante diferente de la de color rojo.
Al ver cómo estos colores diferentes
se han movido como una función del tiempo,
podemos aprender algo acerca de la dinámica del glicoma.
Al menos desde la perspectiva de estas glicoproteínas de mucina
que hemos marcado con GalNAz.
De hecho, uno puede usar un microscopio confocal para recorrer
el organismo etiquetado célula por célula
y mirar muy de cerca lo que ha sucedido
a las mucinas como una función del tiempo durante el desarrollo.
Así por ejemplo, aquí hay un grupo de células epiteliales
y se puede ver que cada célula epitelial se ve como si tuviera
una membrana marcada con rojo y con punctas azules y verdes dentro de la célula.
Lo cual es exactamente lo que cabría esperar,
porque en este experimento el etiquetado rojo
refleja la nueva población de glicoproteínas.
Esas son las glicoproteínas que simplemente
surgieron en la membrana plasmática
con azidas listas para ser etiquetadas.
Por el contrario, las poblaciones más antiguas de glicoproteínas
que se biosintetizaron muchas horas antes
de que tomamos esta foto ya han sido recicladas
por vesículas endocíticas en la membrana.
Y es por eso que aparecen al interior de la célula.
Esta es una estructura que era más bien dramática
que se presentó más o menos 72 horas después de la fertilización.
Lo que estamos viendo aquí es una proyección roja
que básicamente sale de la pantalla
hacia nosotros desde la unión de tres células epiteliales.
Esa estructura roja es una estructura del cabello mecanosensorial.
Estas son estructuras que sobresalen de la parte
de la cabeza del embrión,
como se puede ver en esta vista a mayor escala.
Estas son estructuras que
el pez cebra puede utilizar para detectar el flujo de corriente en su entorno,
por ejemplo.
El hecho de que hayamos capturado esta estructura tan dramáticamente en rojo
nos dice en primer lugar que debe contener estas glicoproteínas parecidas a la mucina
porque de lo contrario no podríamos verla
porque eso es lo que estamos visualizando.
En segundo lugar, esto nos dice que la mayoría de las glicoproteínas
se formaro entre
72 y 73 horas después de la fertilización.
Sería una ventana muy difícil de capturar
usando otras tecnologías imagenológicas clásicas.
Así que éstos son los tipos de estudios que básicamente nos dan acceso
a la biología del desarrollo mediante la imagenología de los azúcares.
Creo que ésta es una aplicación
muy interesante para el futuro de la tecnología.
¿Qué deben Uds. llevar a casa de esta segunda conferencia
en esta serie? En primer lugar, hay una lección química aquí,
que en realidad no tiene nada que ver con los azúcares.
Es el hecho de que hemos aprovechado
de algunas herramientas químicas muy clásicas.
Se trata de una reacción química que se registró por primera vez
ya en 1915. Esto es casi un centenar de años atrás.
Y estos químicos viejos clásicos, la química de Staudinger
y la química de cicloadición de Huisgen,
son auténticas joyas para las aplicaciones modernas de la biología.
Así que al adentrarse en la literatura química antigua,
uno puede encontrar algunas herramientas increíbles
para traspasar a la era moderna de la investigación biológica.
Y eso es muy emocionante para alguien que fue entrenada como químico
y en el fondo se considera químico.
En segundo lugar, Uds. deben recordar la azida.
La azida tiene propiedades fenomenales
que la hacen muy bien adaptada para estas aplicaciones
como mensajeros químicos.
Y creemos que la azida
tiene un gran potencial no sólo para visualizar los azúcares,
como ya lo hacemos, sino también para visualizar
todo tipo de biomoléculas interesantes,
incluyendo proteínas, lípidos, ácidos nucleicos,
metabolitos, cosas que no necesariamente están codificadas en el genoma,
para las cuales las buenas prácticas agrarias y otros mensajeros genéticos no son realmente adecuados.
En tercer lugar, ahora hemos demostrado que el etiquetado metabólico con azúcares de azida
permite visualizar los glicanos en sistemas vivos.
Y creemos que esto permitirá a los científicos
estudiar la glicobiología usando todo el disco duro de la imagen molecular,
que hasta ahora se ha centrado principalmente en el estudio de las proteínas.
Por último, lo que vamos a hacer con esta tecnología en mi laboratorio
es continuar con nuestros estudios de biologías de desarrollo
hasta que podamos comprender cómo contribuye el glicoma
a algunos de los tempranos procesos decisivos en el destino celular
durante el programa embriogénico.
Por ejemplo, ¿cómo cambia el glicoma
cuando células madre embrionarias pluripotentes están empezando
a elegir su destino diferencial final.
Estamos esperando poder capturar
ese momento desde la perspectiva del glicoma.
Finalmente, una de nuestras motivaciones originales
era desarrollar estas herramientas de una manera que
pudiera ser clínicamente útil. Así que esperamos que
podamos desarrollar los reactivos químicos,
los azúcares de azido, de tal manera que se pudiera
realmente introducir estos reactivos en sujetos humanos
y utilizarlos para detectar tumores en etapas iniciales
mediante los cambios en su glicoma.
Así que presten atención, y ojalá que tengamos mucho más que decir
sobre eso en el futuro.
Por último, me gustaría agradecer a los estudiantes
y los becarios postdoctorales en mi laboratorio.
Lo que estamos viendo en esta diapositiva
es una foto de mi laboratorio en este momento particular,
donde estoy mostrando a todos los estudiantes
y postdoctorados que están actualmente en el laboratorio,
aunque he enumerado sólo una pequeña lista de ex-alumnos
a cuyo trabajo he aludido durante esta conferencia.
La mayoría de sus nombres fueron mencionados en realidad en las diapositivas
junto a las referencias a las publicaciones, por si les interesa
indagar más en esto.
Pero hay que decir que todo el trabajo que presenté
de mi laboratorio es, de hecho, la investigación
de mis estudiantes y becarios postdoctorales y yo soy
más que nada la boquilla que tiene el privilegio de compartir esto con el mundo.
Así que, muchas gracias por escuchar, y espero que hayan disfrutado al aprender un poco
sobre la glicobiología química.