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Mi nombre es Ari Helenius y trabajo en el Instituto de Bioquímica en ETH Zurich,
el Instituto Federal Suizo de Tecnología. Hoy les hablaré sobre
la biología celular del ingreso viral y en esta primera parte me concentraré en los aspectos generales
de las interacciones virus-célula. Solo lo relacionado con virus en sistemas animales,
es decir; virus animales. He escogido este título para la primera parte porque muestra que las partículas virales,
una vez que ingresan a la célula, requieren ayuda por parte de ésta.
Múltiples procesos y factores celulares se encuentran involucrados en el ingreso de la partícula viral
hacia la célula, pasando tan inadvertido, que la misma célula ayuda en la infección viral.
Empezaremos primero hablando respecto a la partícula viral. ¿Qué es una partícula viral?
El componente más importante de la partícula viral es su genoma,
el cual está formado por ARN o ADN. El genoma codifica para los genes requeridos
para construir una partícula viral en la célula infectada. Estos genes virales pueden ser
pocos en algunos tipos de virus, y en otros ser más, pero en principio
se trata de genomas pequeños con muy pocos genes que codifican para proteínas. El genoma
en la partícula viral se encuentra en un estado altamente condensado, con la finalidad de
ocupar el mínimo espacio posible. Este proceso puede ocurrir de dos formas distintas,
una es que el genoma se enrolle junto a proteínas, en lo que se conoce como cápside helicoidal, ó como les muestro aquí,
puede encontrarse dentro de una cápside icosahedral. En algunos virus
existen ambas estructuras, el virus se encuentra enrollado con proteínas y luego es recubierto
por la cápside que forma la partícula viral. Lo que tienen ahí, es lo que se conoce como
virus desnudo, que significa que sólo tiene ácidos nucleicos y proteínas.
Un gran número de virus y familias virales tienen además de este tipo de
estructura de cápside central una bicapa lipídica, que es una membrana que rodea
la cápside y proporciona, en este caso, la capa más externa del virus.
La envoltura contiene adicionalmente proteínas codificadas por el virus, llamadas proteínas de envoltura vírica.
Por lo tanto éstas son las dos formas de virus en los sistemas animales,
un sistema viral con envoltura y uno sin envoltura.
La función de la partícula viral por si sóla es bastante simple.
Se trata de una partícula portadora que lleva el genoma viral, y algunas veces
proteínas accesorias de la célula infectada hacia la nueva célula blanco no infectada. Puede ser
una transferencia celular que pasa entre células de un mismo organismo, o puede ser
de un organismo a otro, por ejemplo, de un humano
a otro. De todas formas es la partícula viral la que transmite
la infección entre células. Es importante en este proceso que la partícula
debe ayudar también a que el genoma viral ingrese a la célula, descubrirlo,
y lograr que éste sea entregado en una forma competente para su posterior replicación.
Todo empieza con la partícula viral en el espacio extracelular, luego ingresa a una célula huéspued,
una célula previamente no infectada, y luego dentro de la célula huésped el virus debe desenvolver
su genoma, y luego la célula puede usar la información del genoma
necesaria para producir nuevas partículas virales. Éstas son formadas dentro de la célula,
y eventualmente son liberadas hacia el espacio extracelular
para comenzar todo el ciclo nuevamente. Esto significa que el virus
es un parásito intracelular obligado. El virus no se puede replicar por sí mismo,
siempre necesita de la ayuda y maquinaria de una célula huésped. Existe una gran
variedad de virus, y esta imagen esquemática muestra en la parte superior
algunos virus de ADN, algunos tienen una envoltura de bicapa lipídica,
como estos dos de aquí, esto quiere decir que son virus con envoltura, y en este lado
unos pocos virus desnudos. Este es el virus ***, este es el virus pox,
y aquí arriba tenemos un virus que produce verrugas. Se llama virus del papiloma.
Hablaremos de ello más tarde en esta charla. Aquí abajo observamos los virus llamados con envoltura
que mencioné anteriormente. Todos son virus de ARN. Contienen un envoltura de bicapa lipídica,
algunos tienen una cápside icosahedral como la que se muestra aquí. Otros tienen
una cápside helicoidal como ya mencioné anteriormente.
Aquí arriba está el virus influenza, aquí abajo está el virus SARS, o un virus relacionado,
llamado coronavirus, y en un momento les hablaré respecto a un virus de esta familia,
que se llama alfavirus el cual provoca encefalitis.
Ahora, las partículas virales se ven muy diferentes en el microscopio electrónico micrográfico,
así se ve el virus de la influenza. Las partículas virales no son idénticas en forma,
pero todas tienen esta envoltura y en ella pueden ver las proyecciones
que forman las glicoproteínas de envoltura, que son muy importantes durante
el ingreso del virus a la célula. Este es un alfavirus, el virus Semliki Forest,
del cual también hablaré en un momento. Tiene casi toda su superficie cubierta
por estas glicoproteínas con forma de púa. La envoltura es sólo visible como puntos azules
en el fondo de la cápside. Las próximas son micrografías electrónicas
del virus SARS, un coronavirus. Tiene envoltura y glicoproteínas con forma de púas
en su superficie. El último virus es un virus desnudo, el papilomavirus,
que tiene ésta cápside y el ADN de este virus está adentro de esta cavidad central de la partícula.
Antes de entrar en este tema en más detalle, es importante recalcar que los virus
implican un importante riesgo sanitario en el mundo. Las enfermedades infecciosas en general
son la segunda causa más común de muerte en humanos y la mitad de ellas,
se piensa que son causadas por virus. Existen muchas enfermedades humanas
y animales, como el polio, sarampión, y tantas otras, y también hay enfermedades virales
que están re-emergiendo, que se sabe que son virus humano anteriores
que están ahora extendiéndose y expandiéndose nuevamente en el mundo. Además,
algo que es muy preocupante es que están surgiendo nuevas enfermedades virales.
El virus SARS es un buen ejemplo de ello, otro es el virus del VIH, el cual no siempre
estuvo en la población humana pero que ahora aparece desde diferentes fuentes. También es importante
darse cuenta que algunos virus son agentes potenciales para terroristas
y eso es una preocupación mayor que se debe tomar con seriedad. Ahora sólo les voy a
mencionar unos pocos virus para que tengan una idea de que tan grande es el número
de gente afectada. La enfermedad del SIDA causada por VIH1 está ampliamente extendida.
Se piensa que hoy en día existen 40 millones de personas infectadas, y alrededor de 25 millones
ya han muerto por esta enfermedad. El virus de la hepatitis B es probablemente
la enfermedad humana causada por virus más propagada. Cerca de 400 millones de personas
se encuentran hoy en día infectadas de forma crónica, y un 25% de ellos probablemente
sucumbirán por enfermedades al hígado o cáncer al hígado causado por este virus.
El rotavirus quizás no se conoce muy bien, pero causa grandes problemas en niños,
en particular en América Latina con casi 1 millón de niños falleciendo por causas de este virus al año.
El virus influenza es la mayor amenaza. Se sabe que en la Influenza Española
de 1918-1919, cerca de 40 millones de personas alrededor del mundo murieron.
Por supuesto el virus de la influenza aviar es una potencial amenaza pandémica, H5N1.
El último de la lista es el virus SARS donde el número de personas afectadas
no fue muy grande pero también está claro que hubo enormes pérdidas financieras causadas
por esta infección relativamente limitada. Ahora, la transmisión de un virus
de una persona a otra, de un organismo a otro, ocurre de muchas maneras diferentes.
Una de ellas es el contacto directo, y otra forma importante es mediante
aerosoles, por ejemplo el virus influenza se transmite mediante esta forma. Sin embargo uno no debe
olvidar las picaduras de insecto para aquellos virus portados por insectos, además de contaminantes en la comida y agua,
y jeringas contaminadas, etc. Hemos estado estudiando el ingreso viral
durante muchos años, y para ello hemos estado usando muchas técnicas diferentes. Uno de los
problemas, claro está, es que los virus son extremadamente pequeños. Si tomas una típica partícula viral,
y la magnificas 1 millón de veces la partícula viral sería del tamaño de una naranja.
Eso es 1 millón de veces aumentada. Si tomas una célula huésped y haces lo mismo,
aumentarla, magnificada 1 millón de veces ésta sería del tamaño de una gran carpa de circo.
Por lo tanto lo que siempre me ha fascinado es saber como esta pequeña
partícula, en relación a su huésped, ingresa a una enorme célula y luego
dentro de horas, en muchos casos, transformarla completamente en básicamente una fábrica de virus,
que produce miles y miles de partículas virales.
Lo que hemos estado usando es una serie de aproximaciones que vienen por una parte de
la virología, obviamente, pero también usamos biología celular y molecular
como importantes técnicas. Además, se requiere de la bioquímica y biofísica
y más recientemente hemos tratado de aplicar técnicas
de biología de sistemas y ciencia computacional. Verán algunos ejemplos
de ello en un momento. Más específicamente, lo que hacemos
y hemos hecho en este campo es el uso sofisticado de microscopía óptica y electrónica.
La microscopía óptica se utiliza ahora principalmente en experimentos con células vivas. También tomamos ventaja
de los sistemas in vitro, en unos minutos verán un ejemplo de bicapas lipídicas
sin células utilizadas en estudios de ingreso viral. Actualmente los biólogos
y biólogos moleculares están particularmente diéstros en experimentos de perturbaciones,
en donde uno puede perturbar a la célula y virus de muchas formas diferentes y luego encontrar
como esto afecta a la infección al usar por ejemplo inhibidores químicos,
virus mutantes, células mutantes y también posteriores modificaciones celulares
usando constructos dominantes inactivos y activos. Además,
uno puede modificar las células usando siRNA y como luego esucharan ustedes pueden usar
esta tecnología de silenciamiento mediante siRNA para aplicarlo a mapeos automatizados de alto rendimiento
para encontrar proteínas celulares involucradas en la infección. Bueno, aquí ven
donde comenzó el estudio hace muchos años atrás. Nosotros estabamos tratando de entender cómo
el virus Semliki Forest, un pequeño virus de ARN con envoltura, podía entrar a las células en cultivos de tejidos.
La superficie de la célula se muestra aquí por microscopía electrónica, entre sus características se
incluyen los filopodios, éstos son largas extensiones de la membrana plasmática que contienen actina,
lo que tenemos aquí es probablemente un lamelipodio,
otra estrucutra comúnmente presente en la superficie celular. Sin embargo, lo más importante
son estos pequeños puntos que se ven aquí que corresponden a partículas virales pegadas a la superficie celular,
algunas están siendo internalizadas mediante envaginaciones como aquí
y ahí, y hay otras por aquí arriba. Aquí hay una donde la partícula viral está desapareciendo
dentro de la superficie celular en una envaginación profunda. Lo que pasa
es que el virus está siendo internalizado por endocitosis, la partícula unida
es primero tomada por una fosa recubierta por clatrina y éstas se envaginan formando así
vesículas recubiertas por clatrina, mediante esta vía estándar de endocitosis
el virus es llevado a un organelo llamado endosoma. En este endosoma
el virus se expone a un pH reducido, alrededor de 6, el cual induce un
cambio conformacional en las glicoproteinas puntiagudas
lo que conlleva a la activación de la fusión de membranas entre
la envoltura viral y la membrana limitante del endosoma.
Como resultado, la cápside icosahedral, con su genoma de ARN es liberado hacia
el compartimento citosólico y casi inmediatamente pierde su cubierta proteica. Eso significa que
la cápside se desmorona, el ARN viral se libera y luego es utilizado aquí
como ARN mensajero para la síntesis de las primeras proteínas virales.
Así es como se ve mediante microscopía electrónica. Observen el primer paso donde el virus está siendo
internalizado en una fosa recubierta por clatrina que contiene este material electrónicamente denso
en el lado citosólico, estas son vesículas recubiertas por clatrina. En algunos casos
uno puede incluso observar cómo la cápside aquí abajo está siendo liberada desde
una estrucutra endosomal antes de que ésta tuviera tiempo para despojarse de su cubierta. Muchos estudios
como este con diferentes viruses, han demostrado como es la via general
de ingreso de un virus. El ingreso viral
e infección siempre comienzan con la unión del virus a la superficie celular.
Éste se une a receptores, es decir componentes de superficie celulares, que sirven
de sitios de unión para el virus, y luego de unirse la partícula viral típicamente
comienza a moverse sobre la superficie, lateralmente a través de la membrana.
Durante este tiempo el virus ya está induciendo señales al activar las vías de señalización
propias de las células y de esta manera el virus prepara a la célula para la invasión.
Luego una de las cosas que típicamente ocurren es que las partículas virales son internalizadas
mediante distintos mecanismos de endocitosis. Existen algunas familias virales
que son capacez de penetrar e ir derechamente a través de la membrana plasmática
sin endocitosis, sin embargo la mayoría es primero endocitado. Las vesículas endocíticas
que son formadas llevan el virus hacia un organelo secundario dentro de la célula.
En el caso del virus Semliki Forest, éste organelo sería un endosoma temprano,
y aquí luego la penetración de la cápside hacia el citosol es gatillado
por las condiciones en este compartimento. El siguiente paso, una vez que el virus ha llegado
al citosol, es el movimiento hacia el lugar donde ocurre la pérdida de la cubierta protéica
y la replicación viral. Para la mayoría de los virus de ADN esto involucra
el transporte a través de microtúbulos hacia el núcleo y hacia el complejo poro nuclear.
Luego, a través de diferentes mecanismos el genoma puede ser transportado a través del
poro nuclear y hacia el núcleo, y luego pierde la cubierta proteica durante este proceso.
Los virus que se replican en el citosol tiene otros lugares diferentes hacia
donde son llevados. Por lo tanto, mientras observan toda esta vía pueden ver que
hay todo un programa de etapas, una consecutiva a la otra, resultando finalmente
en el transporte del genoma hacia un lugar específico donde
se lleva a cabo la pérdida final de la cubierta que cubre el genoma.
Muchos virus han sido analizados por nosotros y otros investigadores, y el panorama general
está comenzado a surgir y a continuación resumiré básicamente las principales etapas.
Primero que todo, el proceso de ingreso ocurre en múltiples pasos. No es un proceso muy simple.
Se debe pasar por cada etapa sino no ocurre la infección.
Mientras el virus se mueve desde la membrana plasmática hacia adentro de la célula, más y más profundo,
ese programa se conecta a un programa de desenvoltura al final del cual
el genoma viral es luego liberado en un estado en que puede ser replicado.
Por lo tanto, el ingreso y la desenvoltura van de la mano. La partícula viral por si misma
está construida de tal manera que trae consigo el programa de desenvoltura
y lo que esto significa en la práctica es que las proteínas,
todas las partículas virales por si mismas, son estructuralmente metaestables. Esto significa que estas proteínas
y la cápsides pueden experimentar grandes cambios en respuesta a cambios bioquímicos,
los cuales en este caso son generados por la célula. Yo ya les di un ejemplo,
que era el bajo pH en el endosoma temprano que gatilla un cambio
en la glicoproteína puntiaguda del virus Semliki Forest,
y la transforma en una proteína de fusión. Este tipo de señal es importante, el bajo pH en este caso,
es una señal dada por la célula. Pero existen muchas otras señales, ya llegaré a eso,
El punto principal es que la célula está entregándole información al virus.
Haz esto, haz eso. Básicamente el virus es un hombre ciego y la célula lo toma
por la mano y lo lleva a través de la célula y a través del programa de ingreso.
Por lo tanto, lo importante desde el primer momento de contacto es
la presencia de factores y procesos celulares. El virus depende de ellos
en cada etapa del programa de ingreso. Son componentes muy críticos.
Ahora, en el diálogo entre la partícula que está ingresando y la célula, no es sólo la célula
que provee de información al virus, sino que también el virus comienza un diálogo con la célula
en donde se gatilla la activación de estas vías de señalización, de esta manera
la información es dada tanto por el patógeno como por el huésped. Es muy importante,
en un sentido muy general, es que la partícula viral pueda hablar
el mismo lenguaje que la célula. Éste debe saber los código PIN y todas las claves y debe
saber exáctamente cómo activar los procesos y funciones celulares que requiera.
Por lo que eso es probablemente el conocimiento más importante que se ha obtenido a través del estudio
de muchos virus distintos y sus células huésped. Ahora, si observamos los tipos de señales
que mencioné que requerían los diferente virus para pasar por el estricto proceso
de su programa de ingreso, a bajo pH, como pueden ver aquí, la exposición a bajo pH es
una señal muy común, pero no es la única. Muy a menudo los virus requieren señales
al unirse a moléculas específicas de la superficie celular, llamados receptores virales,
que inducen cambios. El bajo pH es otro. También a veces la célula tiene
que inducir cortes en proteínas virales específicas de manera de poder activarlas
y en algunos casos el re-ingreso del virus desde el espacio extracelular, que es oxidante,
hacia el ambiente reductor del citosol sirve como una señal.
Todo tipo de cosas diferentes se acumulan y ayudan al virus a hacer lo que deben hacer.
En algunos casos su exposición a enzimas específicas como tiol oxidoreductasas.
Entonces el virus se expone a estos cambios y es modificado por la célula
para activarse mientras ingresa. Un último punto muy importante
es que hay una diferencia básica en la estrategia utilizada por virus con envoltura,
aquellos que tienen una bicapa lipídica, y aquellos que no la tienen, los virus desnudos.
Los virus con envoltura realizan la transferencia de su genoma de una forma muy elegante
e inteligente. Usan el mismo principio por el cual las células por si mismas
transfieren macromoléculas desde un compartimento membranoso
a otro, esto es mediante un mecanismo de transferencia de vesículas en donde el cargamento, en este caso la cápside,
un complejo macromolecular grande, es llevado dentro de una vesícula, aquí,
y esta vesícula mediante fisión se desprende, en este caso
la membrana plasmática con la cápside en su interior. Esta cápside es luego transferida
a una nueva célula y luego mediante una reacción de fusión de membranas, en la membrana plasmática
o en un compartimento endocítico, se libera la cápside al citosol.
Como pueden ver aquí la membrana plasmática no es siempre el lugar
donde el virus puede ser formado, sino que también puede ocurrir en organelos intracelulares.
Sin embargo, lo más importante es que la estructura macromolecular del virus
no requiere pasar a través de una barrera hidrofóbica como la bicapa, sino que todo se lleva a cabo
mediante reacciones de fisión, fusión o fusión acoplada de membranas. Por otro lado, los virus desnudos
tienen un problema mucho mayor. Éstos no tienen membrana, por lo que no pueden llevar esto a cabo.
Típicamente salen de la célula infectada mediante un evento lítico. Éste rompe
la membrana y el virus es liberado. Mientras ingresa a una nueva célula
éstos deben lisar las vesículas, luego regresaré sobre este punto respecto
al tipo de mecanismo que deben utilizar. Típicamente estos mecanismos no están
tan bien caracterizados como aquellos utilizados por los virus con envoltura. Ahora quiero hablarles
de algunos eventos tempranos que ocurren en la membrana plasmática y luego
en la segunda charla les hablaré sobre los eventos intracelulares. Entonces regresemos
al principio. Ahora el virus debe unirse a la superficie celular. Esa etapa es
muy importante por muchas razones. El virus no puede infectar a una célula
a la cual no se pueda unir, por lo tanto debe haber un primer contacto y unión o de otra forma
nada ocurrirá, la célula no será infectada.
Los receptores virales de los cuales les he estado hablando son
proteínas típicas y normales de la membrana plasmática celular. Pueden ser proteínas,
lípidos o carbohidratos. Los virus han evolucionado para usar algunos de éstos
para unirse y mediar su ingreso a las células. Hoy en día distinguimos
entre dos tipos de uniones. Uno de éstos es lo que se hace llamar factores de unión. Estos factores
simplemente unen al virus y ayudan a concentrar las partículas virales en la superficie de la célula.
Luego, participan los verdaderos receptores. Los receptores además
de unir al virus, ayudan dandole información al virus, por ejemplo
al inducir cambios conformacionales. Podrían ser beneficiosos en generar señales
como las que mencioné antes, o podrían estar involucrados en la endocitosis de las partículas.
Por lo tanto, no sólo unen. Muchos virus pueden usar más de un tipo de receptor.
Algunos usan dos o más receptores consecutivamente. Ustedes podrían saber que el VIH utiliza dos.
También es importante darse cuenta que la unión es generalmente multivalente, por lo que el virus se une
a más de un receptor a la vez. Por lo que hay muchos contactos con la superficie celular.
Ahora, el tipo de moléculas que sirven como receptores son variables. Éstos dependen
de que virus se trate. Esta imagen muestra algunas moléculas
y los virus que las usan, y como pueden ver en este caso estas proteínas de superficie celular
son bastante diferentes. EL receptor escogido por un virus es muy importante
porque determina qué tipo de célula en el cuerpo y qué especie
puede ser infectada por el virus. Por lo tanto, un virus sólo puede infectar aquellas células que tengan
aquel receptor particular en su superficie al cual éste se pueda unir. Eventualmente, el receptor escogido
es muy importante en la determinación de qué células son infectadas y qué tipo de enfermedad
resulta a partir de la invasión de la partícula. No veremos esto en detalle.
Estas son glicoproteinas y proteínas que vienen de muchas familias distintas
para virus diferentes. Por el lado del virus debe existir claramente algo que
se una al receptor, y eso también varía. Por ejemplo, en virus animales con envoltura
las glicoproteínas que recubren la superficie de la membrana
son las que se unen a los receptores. Por ejemplo en este caso, en el virus de la influenza
la estructuras azules que se observan aquí son moléculas de hemaglutinina influenza
que son responsables de unir receptores que contienen ácido sialico.
En virus desnudos, como en el adenovirus que ven aquí abajo,
el primer contacto con el primer receptor es através de las fibras y los pequeños botones al final de las fibras.
Aquí hay un rinovirus, el cual se une a esta molécula receptora amarilla
mostrada en esta estructura cristalina que en realidad se une a pequeñas hendiduras
presentes en la superficie del virus. Por lo tanto, pueden ser protuberancias o
hendiduras de superficie. Por lo tanto, los virus han desarrollado sitios específicos que pueden unir
múltiples receptores como éste. Ahora, como ejemplo veamos a un virus específico.
En este caso es el virus del Simio 40, miembro de la familia poliomavirus.
Es un virus desnudo y su estructura está extremadamente bien caracterizada
como pueden ver aquí mediante cristalografía de rayos X. La partícula está compuesta por
una proteína de superficie llamada VP-1, la cual está presente en estas estructuras con forma de dona
en donde cada una contiene cinco moléculas VP-1.
Existen setenta y dos de estos pentámeros, cinco oligómeros , organizados
en una estructura icosahedral con simetría T=7.
La molécula VP-1 es la que se une al receptor, y en este caso el receptor
es una molécula lipídica, el gangliósido llamado GM1.
Aquí hay una imagen de dicho gangliósido. Es un esfingolípido.
Tiene un fracción de carbohidratos y una molécula VP-1 que se une a algunos azúcares
en esta fracción. Aquí hay una estructura cristalina recientemente publicada que muestra
exáctamente como funcionan estas interacciones. Aquí tienen el pentámero visto desde el lado,
y las fracciones de azúcares se muestran en los sitios de unión en la superficie de este pentámero.
Aquí la interacción con el receptor está extremadamente bien caracterizada.
La superficie tiene múltiples sitios, cada pentámero puede unir cinco moléculas receptoras.
Lo que ven aquí es la superficie de células CV-1, una célula huésped para SV-40,
y las partículas virales, en este caso partículas SV-40, se han marcado
fluorescentemente por lo que son visibles en la superficie de una célula viva usando
microscopía por reflexión total interna. Algunos son, como éste,
fijo en un lugar, no se mueve más. Otros se están moviendo
de manera aleatoria alrededor de la superficie celular. Si uno observa partículas virales
cuando se están uniendo inicialmente, éstas primero pasan por una fase donde son móviles
y luego se detienen, bastante, o quizás se dispersan un poco,
pero hay un movimiento libre aleatorio seguido de la fijación del virus en un lugar.
Luego, eventualmente las partículas virales son endocitadas.
Ahora, es posible en este caso estudiar esta interacción en un sistema libre de células,
en donde uno simplemente toma vesículas lipídicas, vesículas lipídicas artificiales, liposomas,
que contienen el receptor GM1 que les permite interactuar con
el cubre objeto o la superficie vidriosa para formar una bicapa uniforme en la superficie,
el cual luego unirá partículas virales y si haces eso así es como se ve,
las partículas se unen como lo hacen en la superficie celular y ahora todas son móviles.
Todas se están moviendo y su movimiento es completamente aleatorio.
Ahora, en este caso esta bicapa lipídica sirve como un sistema de modelo para la membrana plasmática.
Ahora, para conocer en más detalle como funciona este movimiento, si el virus se está deslizando sobre
la membrana o rodando, hemos colaborado con excelentes biofísicos
en el ETH de Zurich, principalmente con Philipp Kukura y Vahid Sandoghdar,
quienes han podido abordar esta pregunta siguiendo la partícula viral con una nueva tecnología
que se llama detección interferométrica de dispersión, iSCAT. Se trata de un
sistema de detección libre de marcaje donde pueden seguir la partícula viral misma y acoplamos
una sonda fluorescente de un punto cuántico, uno solo a la partícula viral,
y eso luego puede ser seguida por fluorescencia.
El sistema permite una resolución espacial casi molecular y una resolución temporal extremadamente alta.
Al combinar en este caso el seguimiento de la partícula viral
y el punto cuántico, es posible obtener información tridimensional
respecto al movimiento de la partícula en la superficie de bicapas lipídicas.
Esto muestra nuevamente el sistema. Tenemos una partícula viral con un solo punto cuántico.
Podemos seguir la partícula viral no por fluorescencia, sino que por interferometría,
y este es el tipo de puntos que se ven en el microscopio.
Por supuesto la microscopía óptica te permite ir hasta 200-300 nanometros,
pero dado a que se conoce exactamente el tamaño de la partícula viral, podemos definir el centro
de uno de estos desde la función del punto de expansión con 2 a 3 nanómetros de resolución.
Por lo que la resolución del sistema es extremadamente bueno, es casi tan bueno
como para encontrar exáctamente donde está localizado el punto cuántico.
Entonces ahora cuando uno combina el análisis interferométrico
con el análisis de fluorescencia uno puede obtener la trayectoria
del movimiento del virus sobre la superficie celular donde uno puede ver que el punto cuántico
y la partícula no están siguiendo exactamente la misma trayectoria.
Se mueven de forma levemente distinta, y en todo el trayecto se siguen
y luego utilizando computadores uno puede analizar
su significado en términos de la estructura 3D. Aquí pueden ver el resultado de aquello.
Entonces, esta es la superficie de la bicapa lipídica que contiene el receptor,
y la partícula viral se mueve aleatoriamente alrededor. No está exactamente deslizándose
ni tampoco pareciera estar rodando, sino que esta bamboleándose,
probablemente moviendose de un receptor a otro.
Esto es lo que esperamos que también ocurra en la superficie celular.
Ahora, antes de terminar esta sección me gustaría hablar un poco respecto al
comportamiento de este virus en particular sobre la superficie. Se trata del virus papiloma humano 16,
la mayor causa de cáncer cervical. Es un virus de ADN,
desnudo, de 55 nanómetros de diámetro. Se replica en el núcleo
y los receptores para este virus no se conocen del todo pero se infiere que utilizan
un importante componente, proteoglicanos sulfato de heparano.
El virus es activado mediante ácido y está entrando mediante endocitosis. Mediante microscopía electrónica
se muestra que al virus en la superficie celular le gusta unirse a filopodios.
Estas son las extensiones que contiene actina. Pueden verlas
en una sección aquí y las partículas virales unidas. Muchos virus se unen
a los filopodios como verán más tarde. Aquí hay un aumento
de una partícula y la membrana plasmática debajo de ésta.
Cuando Mario Schelhaas, quien hizo la mayoría de estos estudios junto a Patricia Day y John Schiller en el NIH,
miraron esto, encontraron que las partículas virales cuando se encuentran sobre los filopodios
están realmente moviéndose hacia abajo por los filopodios hacia el cuerpo celular.
Los filopodios aquí se encuentran teñidos con actina marcada con GFP y este movimiento de partículas virales
hacia el cuerpo celular ocurre para muchos virus, esto fue observado por primera vez por Walther Mothes en Yale,
y ahora lo vemos para muchos virus diferentes.
En este caso las partículas virales no se mueven aleatoriamente sobre la superficie celular,
sino que se unen a estructuras específicas y luego se mueven de manera dirigida
hacia abajo sobre los filopodios de actina. El movimiento es completamente
dependiente del flujo retrógrado de actina dentro del filopodio,
la actina también se está moviendo desde la punta de abajo hacia el cuerpo celular.
Ahora, este mismo fenómeno se puede ver, bueno una parte, mediante microscopía electrónica.
Aquí tienen la superficie celular y aquí está el filopodio o el principio de éste
e incluso los filamentos de actina son visibles y este podría ser un virus que se está moviendo hacia abajo,
hacia el cuerpo celular. Lo que luego ocurre es la endocitosis de partículas hacia la célula,
la célula ahora internaliza las partículas mediante endocitosis. Aquí vemos una vesícula
que contiene una partícula viral probablemente emanando de la superficie celular
y podemos ver que esto pasa con muchos virus. Son activamente tomados por la célula.
Terminaré aquí, pero quiero permanecer en el tema de la membrana plasmática
y luego en el siguiente seminario les hablaré sobre los siguientes eventos, pero me gustaría resumir
algunos eventos que ocurren aquí. Lo que ocurre aquí, debajo
de esta imagen, es que primero que todo hay una asociación multivalente
del virus con estos receptores. Receptores que se acumulan bajo el virus.
De alguna manera este agrupamiento e interacción de la partícula viral con su receptor
gatilla un acoplamiento transbicapa desde la superficie externa hacia el interior de la célula,
y luego esto activa una vía de señales o más, que informa a la célula
sobre la partícula viral. Básicamente el virus está sentado sobre la superficie y diciendo,
tintín, tintín, tintín, tintín, estoy aquí, haz algo.
Y en este caso como podemos ver, ocurre la activación de un reflejo endocítico
en la célula. Uno u otro mecanismo endocítico
es activado para permitir el ingreso de la partícula viral. Estas vesículas endocíticas luego
ayudan a mover el virus desde la superficie hacia el centro de la célula, y eso es
donde ocurre la penetración hacia el citosol para muchos virus.
Entonces para la primera parte del seminario terminaré aquí, y luego en el siguiente seminario
discutiremos los eventos por los cuales los virus deben pasar luego de haber sido endocitados por la célula.
Muchas gracias.