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Hola.
Hoy vamos a profundizar en las técnicas de inmunodiagnóstico
y en ver cómo se obtienen sus herramientas indispensables:
los anticuerpos.
El inmunoensayo es la técnica por excelencia
para el laboratorio de inmunología y para otros
y necesitamos los anticuerpos monoclonales o policlonales.
Muy rápidamente recordamos lo visto en píldoras previas.
La reacción antígeno-anticuerpo
que se va usar para determinar concentraciones de células
se puede manifestar por las caracerísticas de estas redes
como la capacidad de dispersar la luz
la turbidez que producen en suspensión
y su capacidad de precipitar o aglutinar.
Son las técnicas de aglutinación que veremos en píldoras siguientes.
El anticuerpo se puede combinar con varias sustancias
lo que amplica la diversidad del uso de estas moléculas.
Se combina con enzimas y tenemos técnicas de enzimoensayo
con sustancias radioactivas
aunque estas técnicas estén más en desuso
y, por último, con sustancias fluorescentes
para luego hacer un examen
al microscopio o con otros aparatos
fluorímetros o citómetros que detectan la fluorescencia.
A lo que íbamos en esta píldora:
cómo producir estos anticuerpos en el laboratorio.
Para ello
hay que inyectar en un animal una suspensión de los antígenos.
Utilizaremos un ratón para obtener anticuerpos monoclonales
y un conejo para obtener anticuerpos policlonales.
En el caso de los policlonales se puede utilizar otras especies
como las cabras o las ovejas
pero, sobre todo, los conejos, insisto.
Lo primero que necesitamos es una suspensión del antígeno
que hay que preparar e inyectar en la cavidad peritoneal del animal
en este ejemplo, del ratón
y se deja que se produzca una respuesta inmunológica primaria.
Pasados entre siete y diez días de esta primera inmunización
realizaremos otra inmunización con el mismo antígeno.
Con esto se busca una respuesta secundaria de memoria
más potente y con mayor número de células.
Entonces se sangra al animal
y se va a analizar la sangre
para ver la presencia en ella de anticuerpos.
Aunque si separamos el suero
tendremos una mezcla de anticuerpos dirigidos a los distintos epítopos
que tenía el antígeno, el rojo, el azul o el verde.
Serían anticuerpos policlonales.
Para llegar al monoclonal necesitamos el bazo del animal.
Aquí tendremos clones específicos de nuestro antígeno de interés
y clones inespecíficos del antígeno, como los grises.
Para buscar los que nos interesan
primero hay que fusionar las células B
con unas células tumorales, un mieloma.
Aquí se ve cómo se produce esta fusión.
Estas células fusionadas son hibridomas.
Tienen la capacidad del tumor de recrecimiento permanente
y la capacidad del linfocito B de generar anticuerpos.
Después hay que ver cuáles se han fusionado y cuáles no.
Para ello se ponen en un medio selectivo
y acaban muriendo los linfocitos T sin fusionar.
Después hay que ver cuál de las células B
se ajusta al antígeno de estudio.
Para ello hay que hacer la técnica de dilución límite
que calcula que podemos sembrar en un pocillo una o menos células B.
En este caso son hibridomas pero capaces de producir anticuerpos.
Habrá algunos clones que producen anticuerpos de interés
y otros que producen anticuerpos irrelevantes
para nuestro interés de diagnóstico.
Después de unos días en un incubador en determinadas condiciones
estas células se replicarán
y formarán los clones que sintetizarán inmunoglobulina.
En los que no había células, no hay crecimiento
y no hay anticuerpos.
Ahora hay que saber cuál de estos seis ejemplos
produce anticuerpos frente al epítopo de interés
o cuál es irrelevante.
Hacemos réplicas de las placas
y haremos inmunoensayos
enfrentándolos a nuestro antígeno de interés
para ver cuál reacciona y cuál no con nuestro antígeno
y, por tanto, cuál de estos clones es un anticuerpo monoclonal
que interese para la técnica que estamos diseñando.
Hemos dispensado la placa
y ponemos los clones en contacto con nuestro antígeno original.
Veremos cuál produce reacción y cuál no.
En los que no hay crecimiento, no se va a producir reacción.
Donde hay anticuerpos
algunos reaccionarán frente a las partículas del antígeno
y en otros pocillos habrá anticuerpos que no reaccionen.
En los que hay reacción estarán los anticuerpos monoclonales
que son los marcados como reacción positiva
y los de reacción negativa ya no los vamos a usar.
Vamos a hacer una resiembra con los de reacción positiva
de estos hibridomas en gran cantidad de líquido.
Lo metemos en un incubador para obtener lo de la imagen:
muchísimas células B productoras de mucha cantidad de anticuerpo
que utilizaremos para la técnica.
Los hibridomas se pueden reinyectar en los animales también
y en el líquido ascítico
se puede obtener una gran cantidad de anticuerpos
como vemos en la imagen.
Reacciona en el animal y se produce en cantidades masivas.
Así hay dos maneras de obtenerlo en grandes cantidades.
¿Está listo ya el anticuerpo para las técnicas diagnósticas?
Para algunas.
Para otras habrá que conjugarlo con enzimas
con sustancias fluorescentes o radioactivas entre otras.
En esta píldora hemos repasado
las técnicas de inmunoensayo que se utilizan en el diagnóstico
la metodología básica para producir anticuerpos policlonales
y la metodología para producir anticuerpos monoclonales.
Podrías preguntarte si sabes las siguientes cuestiones:
Para las técnicas de aglutinación y precipitación
¿es mejor usar anticuerpos monoclonales o policlonales?
¿Qué anticuerpos se utilizan para técnicas de inmunofluorescencia?
¿En qué animales se producen los anticuerpos policlonales?
¿En qué animales se producen los anticuerpos monoclonales?
¿Cuántas inmunizaciones se necesitan para obtener anticuerpos?
¿Los anticuerpos monoclonales se obtienen del bazo del animal?
Los anticuerpos monoclonales obtenidos en animales
¿sirven para todas las técnicas sin más modificaciones?
Si lo sabes todo vete ya a estudiar las técnicas
sino, dale un repaso y nos vemos en la próxima.
Hasta pronto.