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Bienvenido a la Serie Protocolo Novus Visual.
En este episodio le mostramos cómo realizar todas las fases del fluorescente
inmunocitoquímica
utilizando los métodos más comunes para este ensayo.
Antes de comenzar el procedimiento de la ICC, vamos a demostrar cómo preparar
cubreobjetos y las placas de cultivo celular seguido por la siembra en placa de las células.
Comenzamos el tratamiento de ácido cubreobjetos nuevos en un molar de ácido clorhídrico para
24 horas.
Después de decantar cuidadosamente el ácido y la eliminación de los cubreobjetos de vidrio,
nos lavamos cada una con agua destilada,
luego un enjuague final con etanol.
Como paso opcional se puede colocar el cubreobjetos en un rack subbing
sumergirla
un 0,1 mg / solución de gelatina o polilisina
durante cinco minutos.
Estos recubrimientos ayudante para proporcionar adherencia adicional de las células a la
cubreobjetos
asegurando que no se han separado durante los pasos de lavado posteriores.
Después del tratamiento retirar la parrilla subbing y secar los cubreobjetos en la cultura
campana o en un horno caliente.
Limpieza cubreobjetos secos se insertan entonces en cada pocillo de una de seis pocillos
cultivo en placa
y cubierto con una tapa.
Para ahorrar tiempo, grandes cantidades de platos se pueden preparar con anticipación para su uso posterior.
Las placas también se pueden esterilizar por su inclusión en la luz UV de la campana.
Con cubreobjetos limpios preparados en placas de seis pocillos,
ahora podemos añadir nuestras células.
Platted aquí en las células de añadir una densidad de un medio millón de células por pocillo.
Después las células se cultivaron durante la noche en la incubadora o hasta que alcanzan su preferida
densidad.
Con las células chapada en el día anterior y durante la noche cultural, estamos listos
para comenzar con el procedimiento de la ICC.
En este primer día de la CPI, vamos a arreglar,
permeabilizar,
borrar y añadir un anticuerpo primario a las células.
Iniciar mediante la aspiración de medio de cultivo de cada pocillo seguido de la fijación de la
las células con formaldehído al 4% o formalina al 10%
durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Aspirar fijador y enjuagar cada pocillo dos veces con PBS enfriado con hielo.
Tenga cuidado de no permitir que las células se secan en este
o cualquier otra etapa del protocolo.
Si el epítopo de la proteína de interés se expresa intracelularmente,
permeabilización celular es necesaria para el anticuerpo para obtener acceso a la
célula.
Aunque hay muchos diferentes
agentes de permeabilización, las más comunes son .1 a .5%
concentración
de Tween-20
o Triton-X100
diluido en PBS.
Tween-20 se utiliza para epítopos localizados en el citoplasma
mientras Triton-X100 se utiliza para permeabilizar el núcleo y las mitocondrias.
Incubar los pocillos con tampón de permeabilización durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Aspirar permeabilización de amortiguación y se lava tres veces durante 5 minutos cada uno con
PBS hilo.
PBS hilo contiene 0,1% de Tween-20.
Ahora vamos a bloquear sitios de unión no específicos con tampón de bloqueo durante 1 hora
a temperatura ambiente.
El tampón de bloqueo es mejor PBST que contenía 10% de suero desde el host
especies de su anticuerpo secundario.
Sin embargo,
1% de BSA en PBST también se pueden usar.
Preparar el anticuerpo primario por dilución en tampón de bloqueo
a la dilución recomendada especificada por la hoja de datos.
Varias diluciones más estrictos son beneficiosos para tener en cuenta las variables que pueden estar
diferente en su ensayo
y para lograr los mejores resultados.
Incubar a 4 º C durante la noche.
En nuestro ejemplo,
ya que estamos utilizando una primaria no conjugada vamos a utilizar un fluoróforo
secundario conjugado con el segundo día.
En el segundo día de nuestro procedimiento de la ICC
vamos a añadir nuestro anticuerpo secundario,
realizar un doble etiquetado facultativo y de paso etiquetado nuclear,
montar los cubres a diapositivas,
y obtener imágenes de los anticuerpos con un microscopio de fluorescencia.
En primer lugar, aspirar solución de anticuerpos de base después del lavado de la célula
tres veces con PBST durante cinco minutos cada uno.
Siguiente preparar el floraform anticuerpo secundario conjugado que se unirá a la primaria
anticuerpo.
Diluir el tampón de bloqueo secundario
con la dilución de recomendaciones especificado en la ficha técnica
temperatura ambiente y se incubaron durante una hora.
Cubrir las placas con papel de aluminio evita los tintes sensibles que se degrade.
Aspirar fuera de la solución de anticuerpo secundario seguido por lavado de las células
tres veces con PBST
durante cinco minutos cada uno.
Como un paso opcional de un segundo par primario y secundario puede ser utilizado
para visualizar un segundo epítopo
mediante el uso de un piso diferente para ella.
Además, los colorantes de unión al ADN tales como DAPI
puede ser aplicado sin la necesidad de anticuerpos secundarios.
Consulte el Protocolo Novus completa por escrito para obtener más instrucciones sobre cómo duplicar y
etiqueta triple.
Cubreobjetos ahora está listo para ser montado en portaobjetos de microscopio.
Tomar un portaobjetos limpio y dispensar una gota de medio de montaje Antifade lentamente
marcación hacia abajo el émbolo de la pipeta.
Retire con cuidado el cubreobjetos del pozo,
permitir que el exceso de lavado se escurra
y colocar las celdas hacia abajo en la diapositiva.
Esmalte de uñas transparente se puede utilizar para sellar el cubreobjetos y evitar que se
seque.
Diapositivas ahora puede ser visualizado bajo un microscopio
o se almacenaron a -20 o 4 grados Celsius
en una caja de portaobjetos oscuro o un libro de diapositivas.
Limitar la cantidad de tiempo de exposición de cada diapositiva a la luz del microscopio se ayudante en
la prolongación de la señal fluorescente
y evitará que se han blanqueado.